3.2 PHƯƠNG PHÁP
3.2.6 Thí nghiệm 6: Xác định hàm lượng β-1,3-glucanase của các chủng
* Mục tiêu
Đánh giá cơ chế đối kháng của các chủng xạ khuẩn thông qua khả năng tiết enzyme β-1,3-glucanase phân hủy vách tế bào nấm.
* Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên một nhân tố, 6 nghiệm thức với 4 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức là một chủng xạ khuẩn triển vọng.
* Cách thực hiện
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Renwich et al. (1991). Bước 1: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MS trong đĩa petri khoảng 7 ngày. Sau đó, bơm 5ml nước cất đã được thanh trùng vào đĩa, tiến hành cạo, lược qua vải lược vô trùng để thu lấy huyền phù bào tử xạ khuẩn. Thực hiện phương pháp pha loãng, chà đếm mật số để đưa huyền phù bào tử xạ khuẩn về mật số 108 (cfu/ml).
Bước 2: Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm cách đều nhau lên đĩa petri chứa 10ml môi trường có chứa cơ chế β-glucan, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (đường kính 5 mm) được tẩm huyền phù xạ khuẩn của mỗi chủng.
Bước 3: Các đĩa thí nghiệm được đặt ở điều kiện nhiệt độ phịng. Xác định hoạt tính enzyme β-1,3-glucanase ở từng thời điểm bằng cách tráng dung dịch Congo – red 0,6% lên bề mặt đĩa thạch, đổ bỏ phần dung dịch Congo – red 0,6% thừa và tráng lại bề mặt với nước muối (NaCl 0,9%), rồi để yên ở nhiệt độ phòng trong 90 phút.
* Chỉ tiêu theo dõi
Đo bán kính vòng phân giải β-1,3-glucanase (mm) là vùng không bắt màu thuốc nhuộm ở các thời điểm 3, 5 và 7 ngày sau khi cấy.
3.2.6 Thí nghi ệm 6: Xác định hàm lượng β-1,3-glucanase của các chủng xạ khuẩn triển vọng khuẩn triển vọng
* Mục tiêu
Xác định hàm lượng enzyme β-1,3-glucanase của các chủng xạ khuẩn
triển vọng tiết ra thông qua phương pháp so màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicyllic acid).
23
* Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên một nhân tố, 6 nghiệm thức với 4 lần lặp lại.
* Các thực hiện:
Thực hiện dựa theo phương pháp của Gopalakrishnan et al. (2014):
Bước 1: Chuẩn bị các hóa chất:
Dung dịch cơ chất nền 2% laminarin pha trong dung dịch 0,2 M Na-acetate (pH = 5,4).
Dung dich NaOH 1N: cân 20g NaOH pha trong 500 ml H2O.
Dung dịch 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid (DNS): cân 10 g DNS cho vào bình, bổ sung thêm 300 ml nước cất, khuấy đều. Thêm từ từ 400 ml dung dịch NaOH 1N vào, vừa thêm vừa khuấy đều ở nhiệt độ không quá 50ºC. Thêm 300 g Tartrat K Natri vào dung dịch trên, tiếp tục khuấy đều ở nhiệt độ trên, để nguội về nhiệt độ phòng, thêm nước cất và khuấy đều để được dung dịch đạt 1000 ml. Bảo quản trong chai nâu có nắp đậy.
Dung dịch glucose nồng độ 1 mg/ml: Hòa tan 100 mg Glucose với 100 ml nước cất.
Bước 2: Xây dựng đường chuẩn Glucose
Bảng 3.3 Xây dựng đường chuẩn Glucose
Số thứ tự các ống 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 C ác c h ất b ổ sung ph ản ứ ng ( m l) Dung dịch glucose chuẩn 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Dung dịch laminarin 2% 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Dung dịch DNS 3 3 3 3 3 3 3 Nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
Lắc đều các ống nghiệm này, dùng giấy thiếc bịt kín miệng ống nghiệm, đem đun cách thủy ở 100oC trong 10 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng bằng cách ngâm trong chậu nước mát. Đem đo OD trên máy quang phổ ở bước song 530 nm.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (OD) theo lượng glucose chuẩn ở các ống. Sau đó, tính giá trị hệ số glucose trung bình (F):
24
Bước 3: Chuẩn bị dịch enzyme thô
Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MS trong đĩa petri khoảng 7 ngày. Sau đó, bơm 5ml nước cất đã được thanh trùng vào đĩa, tiến hành cạo, lược qua vải lược vô trùng để thu lấy huyền phù bào tử xạ khuẩn. Thực hiện phương pháp pha loãng, chà đếm mật số xạ khuẩn. Sau 48 giờ, xác định mật số trên đĩa chà rồi thực hiện pha loãng huyền phù xạ khuẩn về mật số 108 (cfu/ml).
Cho 2 ml huyền phù xạ khuẩn đã chuẩn bị vào trong bình tam giác (thể tích 250 ml) chứa 98 ml mơi trường Czapek Dox có bổ sung 1% laminarin (môi trường nuôi dựa theo Helmy et al. (2010) đã báo cáo), sau đó đem ni lắc ở
điều kiện nhiệt độ phòng với tốc độ 100 vòng/phút.
Thu dịch enzyme thô bằng cách lọc dịch nuôi cấy qua vải lược, đem ly tâm ở tốc độ 4500 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy phần dịch bên trên (bình đối chứng khơng có ni lắc xạ khuẩn cũng được thu dịch môi trường bằng cách tương tự) vào các thời điểm 3, 5 và 7 ngày sau nuôi lắc.
Bước 4: Tiến hành xác định nồng độ đường khử của dịch nuôi cấy xạ khuẩn.
Chọn các ống có cùng kích cỡ, cùng độ dày.
Hút 1 ml dịch enzyme thô cho vào ống nghiệm (ống đối chứng: hút 1 ml môi trường nuôi lắc xạ khuẩn), để ổn định ở nhiệt độ 40oC trong 5 phút. Đồng thời song song đó cũng để dung dịch 2% laminarin ổn định ở nhiệt độ 40oC trong 5 phút.
Sau đó thêm 0,1 ml dung dịch 2% laminarin vào ống nghiệm chứa dịch enzyme thô và ống đối chứng. Lắc đều, để phản ứng xảy ra ở 40oC trong 60 phút.
Thêm 3 ml dung dịch DNS vào mỗi ống nghiệm, lắc đều, dùng giấy thiếc bịt kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy ở 100oC trong 10 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát.
Đo OD ở bước sóng 530 nm của các dung dịch. Dựa theo đường chuẩn của glucose tính được nồng độ glucose của mẫu thí nghiệm.
Tính kết quả hoạt tính enzyme (IU/ml):
Một đơn vị hoạt động endoglucanase được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µmol glucose mỗi phút trong điều kiện thử nghiệm.
25
Trong đó:
F: giá trị hệ số glucose trung bình (mg/ml)
OD mẫu phân tích = OD ống có dịch enzyme thơ – OD ống đối chứng
1000: hệ số chuyển đổi mg thành µg
180: trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ µg sang µmol t: thời gian phản ứng (60 phút)
v: thể tích dung dịch enzyme (1ml)