3.2 PHƯƠNG PHÁP
3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tiết enzyme chitinase của các
xạ khuẩn triển vọng
* Mục tiêu
Đánh giá cơ chế đối kháng của các chủng xạ khuẩn thông qua khả năng tiết enzyme chitinase phân giải chitin.
* Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, một nhân tố với bốn lần lặp lại, mỗi nghiệm thức là một chủng xạ khuẩn triển vọng.
* Cách thực hiện
Bước 1: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MS trong đĩa petri khoảng 7 ngày. Sau đó, bơm 5 ml nước cất đã được thanh trùng vào đĩa, tiến hành cạo, lược qua vải lược vô trùng để thu lấy huyền phù bào tử xạ khuẩn. Thực hiện phương pháp pha loãng, chà đếm mật số để đưa huyền phù bào tử xạ khuẩn về mật số 108 (cfu/ml).
Bước 2: Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm lên đĩa petri chứa 10 ml môi trường Chitin agar (chứa 4% colloidal chitin), mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (đường kính 5 mm) được tẩm huyền phù xạ khuẩn (Hình 3.1).
Bước 3: Đĩa petri thí nghiệm được đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng. Ở mỗi thời điểm ghi nhận chỉ tiêu, tiến hành tráng đĩa với dung dịch Lugol (Neergaard, 1997), đổ bỏ phần dung dịch Lugol thừa và trán lại bề mặt agar với nước cất.
* Chỉ tiêu theo dõi
Đo bán kính vịng phân giải chitin (mm) vào các thời điểm 3, 5, 7 và 9 ngày sau bố trí. Vịng phân giải là vùng không bắt màu với thuốc nhuộm Lugol. Nguyễn Thị Hà (2012) cho rằng, chitinase hiện diện trong mơi trường có chứa chitin thì chitinase sẽ phân giải chitin thành N-acetyl glucosamine và các cấu trúc mạch ngắn hơn không bắt màu với thuốc thử Lugol. Khi tác dụng với thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt (vòng phân giải) phản ánh hoạt tính chitinase của chủng xạ khuẩn thí nghiệm.
17