- Tạo củ bi cho giống hoa lay ơn mới bằng phương phâp in vitro
- Tạo củ thương phẩm cho giống hoa lay ơn mới trín đồng ruộng.
3.5. PHƢƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU
3.5.1. Đânh giâ nguồn vật liệu phục vụ cho lai tạo giống hoa lay ơn mới
- Thời gian nghiín cứu: Thí nghiệm được tiến hănh ở vụ Đông Xuđn 2015 - 2016
- Địa điểm nghiín cứu: Trung tđm Nghiín cứu vă Phât triển Hoa, Cđy cảnh, Gia Lđm, Hă Nội
- Bố trí thí nghiệm: Câc mẫu giống lay ơn được bố trí theo khối ngẫu nhiín đầy đủ với 3 lần lặp lại, 300 cđy/giống
- Phương phâp lấy mẫu vă lượng mẫu theo dõi: chọn mẫu ngẫu nhiín (trừ câc câ thể ở đường biín), 10 mẫu/ô thí nghiệm. Mỗi ô thí nghiệm có diện tích 5m2, mỗi ô trồng 100 cđy.
3.5.1.1. Đânh giâ câc đặc điểm nông sinh học
- Chỉ tiíu về sinh trưởng phât triển
+ Thời gian từ trồng đến nảy mầm/phđn hóa mầm hoa/trỗ bông/thu hoạch (ngăy): tính từ khi bắt đầu trồng đến khi 10%, 80% tổng số cđy trồng đạt chỉ tiíu đó.
+ Chiều dăi lâ (cm): Tổng chiều dăi lâ/tổng số lâ theo dõi. Đo từ gốc lâ đến đỉnh lâ của lâ dăi nhất của cđy.
+ Số lâ/cđy (lâ): Tổng số lâ/tổng số cđy theo dõi. Đếm toăn bộ số lâ hoăn chỉnh từ gốc đến lâ bao đòng.
+ Thế lâ (cấp) đânh giâ theo bảng mô tả của Quy phạm khảo nghiệm tính khâc biệt, tính đồng nhất vă tính ổn định của hoa lay ơn - UPOV 2013: cấp 1 (lâ thẳng), cấp 3 (lâ xiín), cấp 5 (lâ ngang) vă cấp 7 (lâ rủ)
+ Chiều rộng tân lâ (cm): Tổng chiều rộng tân lâ/ tổng số cđy theo dõi. Đo phần rộng nhất của tân lâ.
- Chỉ tiíu về ra hoa vă chất lượng hoa
+ Chiều dăi cănh hoa (cm): Tổng chiều dăi cănh hoa/ tổng số cănh hoa theo dõi. Đo từ gốc đến đỉnh cănh hoa
+ Chiều dăi đoạn mang hoa (cm): Tổng chiều dăi đoạn mang hoa/ tổng số cănh hoa theo dõi. Đo từ gốc của bông hoa đầu tiín đến đỉnh bông hoa cuối cùng. + Đường kính cănh hoa (cm): Tổng đường kính/ tổng số cănh hoa theo dõi. Đo bằng thước Palme ngay ở giữa đốt cổ bông
+ Số hoa/cănh (hoa): Tổng số hoa/ tổng số cănh hoa theo dõi. Đếm tất cả câc hoa có trín cănh hoa
+ Đường kính hoa (cm): Đo theo chiều ngang phần lớn nhất của mặt hoa của bông hoa thứ 2 từ gốc cănh. Đo khi hoa đê nở hoăn toăn bằng thước Palme.
- Chỉ tiíu về năng suất hoa vă củ giống
+ Tỷ lệ trỗ bông (%): số bông trỗ thoât/tổng số cđy trồng x 100
+ Tỷ lệ cănh hoa thu hoạch (%): số cănh hoa thu hoạch/tổng số cđy trồng x 100. Cănh hoa thu hoạch lă hoa không bị sđu bệnh, cănh hoa thẳng, mập... có giâ trị thương phẩm.
+ Cănh hoa loại 1: Chiều dăi cănh >100 cm, số lượng hoa/cănh >10 hoa, mức độ khô đầu lâ <3% chiều dăi lâ
+ Cănh hoa loại 2: Chiều dăi cănh <100 cm, số lượng hoa/cănh 6 - 10 hoa, mức độ khô đầu lâ <5% chiều dăi lâ
+ Số củ bi/củ (củ): Tổng số củ bi hình thănh/ tổng số củ theo dõi.
- Chỉ tiíu theo dõi mức độ sđu hại: phđn cấp theo Quy chuẩn Kỹ thuật Quốc gia về phương phâp điều tra phât hiện dịch hại cđy trồng QCVN01- 38:2010/BNNPTNT
Cấp 1: Nhẹ (xuất hiện rải râc)
Cấp 2: Trung bình (phđn bố dưới 1/3 cđy) Cấp 3: Nặng (phđn bố trín 1/3 cđy)
- Chỉ tiíu theo dõi bệnh hại
Tỷ lệ cđy bị bệnh (%): số cđy bị bệnh/tổng số cđy trồng thí nghiệm.
- Chỉ tiíu theo dõi mức độ khô đầu lâ
Mức độ khô đầu lâ được phđn cấp dựa văo tỷ lệ chiều dăi vết chây so với chiều dăi lâ:
Cấp 1: < 1% chiều dăi lâ bị hại Cấp 3: 1 đến 5% chiều dăi lâ bị hại Cấp 5: > 5 đến 25% chiều dăi lâ bị hại Cấp 7: > 25 đến 50% chiều dăi lâ bị hại Cấp 9: > 50% chiều dăi lâ bị hại
3.5.1.2. Đânh giâ đa dạng di truyền câc giống lay ơn nghiín cứu
- Phđn nhóm câc giống lay ơn dựa văo hình thâi
Hệ số tương đồng di truyền Jaccard vă phương phâp UPGMA trong NTSYSpc 2.1 được sử dụng để phđn tích, đânh giâ sự đa dạng di truyền vă phđn nhóm (cđy di truyền) câc mẫu giống lay ơn nghiín cứu. Câc tính trạng đặc trưng được sử dụng lă dăi lâ, số lâ, thế lâ, dăi cănh hoa, dăi đoạn mang hoa, đường kính cănh hoa, số hoa/cănh, đường kính hoa, số củ bi/củ, mức độ khô đầu lâ.
- Phđn nhóm câc giống lay ơn dựa văo chỉ thị phđn tử ISSR
Quy trình tâch chiết vă tinh sạch ADN tổng số âp dụng theo phương phâp CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) của Doyle & Doyle (1990).
Kỹ thuật PCR: Phản ứng PCR được thực hiện với thể tích 10µl hỗn hợp gồm 1µl ADN mẫu; 2µl H2O; 5µl PCR Master Mix 2x; 2µl mồi. Nồng độ ADN mẫu lă 10ng vă nồng độ mồi lă 1uM. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR như sau: (1) 950C trong 3 phút, (2) 940C trong 30 giđy, (3) 530C trong 30 giđy, (4) 720C trong 30 giđy, 30 chu kỳ lặp lại từ (2) đến (4); (5) 720C trong 7 phút vă sau đó được giữ lạnh ở 40
C.
Sản phẩm được điện di trín gel agarose 0,8%. Soi gel dưới đỉn tử ngoại vă ghi nhận câc băng ADN phât sâng. Kích thước câc băng ADN khuếch đại được xâc định dựa trín thang chuẩn 1kb Plus DNA Ladder.
Phđn tích kết quả: Từ hình ảnh điện di sản phẩm PCR_ISSR, số liệu theo quy ước (1): phđn đoạn DNA xuất hiện vă (0): phđn đoạn DNA không xuất hiện. Hăm lượng thông tin đa hình (PIC) của mỗi chỉ thị ISSR được xâc định
theo công thức: PIC = 1 - ∑Pij2, trong đó Pij lă tần số allele thứ j của kiểu gen i được kiểm tra. Lập biểu đồ hình cđy theo phương phâp của Nei & Li (1979) trong phần mềm NTSYS 2.1.
3.5.1.3. Ước lượng câc tham số di truyền vă mối tương quan giữa câc tính trạng đặc trưng của hoa lay ơn
Nghiín cứu được tiến hănh bằng việc theo dõi 8 tính trạng số lượng quan trọng của 25 mẫu giống hoa lay ơn: số lâ trín cđy (lâ), chiều dăi lâ (cm), chiều dăi cănh hoa (cm), đường kính cănh hoa (cm), chiều dăi đoạn cănh mang hoa (cm), số hoa/cănh (hoa), đường kính hoa (cm), số củ con/cđy (củ).
Hệ số biến động kiểu gen (GCV) vă hệ số biến động kiểu hình (PCV) được
tính theo công thức: ;
Hệ số di truyền theo nghĩa rộng: H2
b = x 100.Trong đó: Phương sai môi trường σ2e=MSE/r, phương sai kiểu gen , MSg: bình phương trung bình kiểu gen, Mse: bình phương trung bình sai số, r: nhắc lại, phương sai kiểu hình σ2p = σ2g+ σ2e.
Tiến bộ di truyền được tính theo Johnson & cs. (1955): GA = k.H2b × σp; tiến bộ di truyền theo phần trăm trung bình: GAM (%) = . Trong đó, H2b: Hệ số di truyền theo nghĩa rộng, σp: độ lệch chuẩn kiểu hình, k: cường độ chọn lọc, ở âp lực chọn lọc 5% k = 2,06.
Hệ số tương quan được tính toân sử dụng phđn tích tương quan vă hồi quy tất cả câc tính trạng thănh phần bằng phần mềm SPSS ver 20.
Hệ số đường được phđn tích theo phương phâp của Dewey & Lu (1959) vă hướng dẫn của Akintundep (2012):
Po1 + Po2r12 + ……… .Popr1p = ro1 Po2 + Po1r12 + ……… .Popr2p = ro2 Pop + Po2r2p + ……… Po1r1p = rop Trong đó:
Po1, Po2 ……… .. Pop lă câc hiệu ứng trực tiếp của câc biến 1,2 ….p lín biến „0‟.
r12, r13 ……… .r1p ……… .rp (p-1) lă câc hệ số tương quan giữa câc biến độc lập.
ro1, ro2 ……… .rop lă tương quan của câc biến độc lập với biến phụ thuộc. Tâc động giân tiếp của biến thứ i thông qua biến thứ j được tính lă (Poj x rij).
3.5.1.4. Khảo sât đặc điểm hình thâi, sức sống vă chất lượng hạt phấn hoa lay ơn
- Thí nghiệm 1: Đặc điểm hình thâi bao phấn vă hạt phấn của câc mẫu giống hoa lay ơn
Thí nghiệm được tiến hănh trín 25 mẫu giống hoa lay ơn. Bao phấn của mỗi mẫu giống được thu trước khi hoa nở 1 - 2 ngăy, để ở phòng có nhiệt độ 25 - 27oC, độ ẩm không khí 40 - 50%. Mỗi giống thu 90 bao phấn ở câc vị trí hoa ngẫu nhiín, chia văo câc đĩa petri có đânh số. Sau khi bao phấn bung ra, tiến hănh đo kích thước vă kiểm tra độ hữu dục của hạt phấn.
Đo kích thước hạt phấn: Hạt phấn được nhuộm bằng dung dịch KI - I2 1%. Quan sât hạt phấn dưới kính hiển vi quang học 10X (độ phóng đại 100 lần) có trắc vi thị kính. Sử dụng trắc vi vật kính để quy đổi đơn vị tính. Mỗi giống tiến hănh đo kích thước của 30 hạt phấn.
Xâc định độ hữu dục hạt phấn: Nhuộm hạt phấn với dung dịch KI - I2 1%. Sau đó cho lín tiíu bản để quan sât dưới kính hiển vi quang học. Mỗi tiíu bản chọn ngẫu nhiín 3 vi trường để quan sât dưới vật kính 4X (độ phóng đại 40 lần). Câc hạt phấn bắt mău đậm lă câc hạt phấn hữu dục, câc hạt phấn không bắt mău hoặc bắt mău nhạt lă câc hạt phấn bất dục.
- Thí nghiệm 2: Nhiệt độ bảo quản vă sức sống của hạt phấn hoa lay ơn
Thí nghiệm được tiến hănh trín hạt phấn của 5 mẫu giống lay ơn: GL1, GL2, GL3, GL6, GL24 đại diện cho câc mẫu giống trong tập đoăn (câc giống lai của cùng một loăi). Thí nghiệm gồm 3 công thức được bố trí tuần tự không nhắc lại. Mỗi công thức tiến hănh bảo quản hạt phấn trín 10 đĩa petri/ mẫu giống.
CT1: Bảo quản ở nhiệt độ 25 - 27o
C CT2: Bảo quản ở nhiệt độ 7 - 9o
C CT3: Bảo quản ở nhiệt độ -15 - (-17)oC
Câch tiến hănh: Bao phấn của mỗi mẫu giống được thu trước khi hoa nở 1 - 2 ngăy, để ở phòng có nhiệt độ 25 - 27oC, độ ẩm không khí 40 - 50%. Mỗi
giống thu 90 bao phấn ở câc vị trí hoa ngẫu nhiín, chia văo câc đĩa petri có đânh số. Sau khi bao phấn bung ra, hạt phấn được cho văo bảo quản ở câc chế độ nhiệt khâc nhau. Ở câc công thức bảo quản lạnh, đĩa petri sau khi được quấn parafin, được bọc thím túi nilon để trânh thay đổi độ ẩm.
Định kỳ 5 ngăy theo dõi hạt phấn hữu dục bằng dung dịch KI - I2 1%, thử sức nảy mầm vă đo kích thước hạt phấn. Sử dụng môi trường thử sức nảy mầm hạt phấn lă: 300 mg/l Ca(NO3)2.2H2O + 200 mg/l MgSO4.7H2O + 100 mg/l KNO3 + 6,5 g/l agar + 100 mg/l axit Boric + 15 g/l Đường.
- Thí nghiệm 3: Vị trí lấy phấn vă chất lượng hạt phấn
Thí nghiệm được tiến hănh trín hạt phấn của 5 mẫu giống lay ơn: GL1, GL2, GL3, GL6, GL24 đại diện cho câc giống trong tập đoăn (câc giống lai của cùng một loăi).Thí nghiệm gồm 3 công thức được bố trí tuần tự không nhắc lại . Mỗi công thức tiến hănh trín 90 bao phấn/giống chia văo 10 đĩa petri có bao măng paraffin.
CT1: Hỗn hợp phấn của 2 bông hoa thứ 1 & 2 từ gốc cănh (2 hoa đầu) CT2: Hỗn hợp phấn của 2 bông hoa thứ 3 & 4 từ gốc cănh (2 hoa giữa) CT3: Hỗn hợp phấn của 2 bông hoa thứ 5 & 6 từ gốc cănh (2 hoa cuối) Câch tiến hănh: Bao phấn của mỗi giống được thu trước khi hoa nở 1 - 2 ngăy, để ở phòng có nhiệt độ 25 - 27oC, độ ẩm không khí 40 - 50%. Mỗi mẫu giống thu 90 bao phấn ở câc vị trí hoa khâc nhau, chia văo câc đĩa petri có đânh số. Sau khi bao phấn bung ra, hạt phấn được kiểm tra độ hữu dục bằng dung dịch KI - I2 1% vă thử sức nảy mầm. Sử dụng môi trường thử sức nảy mầm hạt phấn lă: 300 mg/l Ca(NO3)2.2H2O + 200 mg/l MgSO4.7H2O + 100 mg/lKNO3 + 6,5 g/l agar + 100 mg/l axit Boric + 15 g/l Đường.
* Chỉ tiíu theo dõi
- Mău sắc bao phấn quan sât bằng mắt thường
- Chiều dăi bao phấn trung bình (cm) = Tổng chiều dăi bao phấn/số bao phấn theo dõi
- Đường kính bao phấn trung bình (mm) = Tổng đường kính bao phấn/số bao phấn theo dõi
- Thời điểm bung phấn tự nhiín (ngăy) được xâc định khi hạt phấn bắt đầu được giải phóng ra ngoăi trín cđy.
- Thời gian bung phấn sau thu (giờ): được tính bắt đầu từ khi thu đến khi bao phấn nứt vă hạt phấn bắt đầu được giải phóng ra ngoăi
- Tỷ lệ bao phấn mở (%) = (Số bao phấn mở /tổng số bao phấn theo dõi) x 100 - Tỷ lệ bao phấn dị hình (%) = (Số bao phấn dị hình /tổng số bao phấn theo dõi) x 100
- Chiều dăi hạt phấn trung bình (µm) = Tổng chiều dăi hạt phấn/số hạt phấn theo dõi
- Chiều rộng hạt phấn trung bình (µm) = Tổng chiều rộng hạt phấn/số hạt phấn theo dõi
- Tỷ lệ D/R = Chiều dăi hạt phấn trung bình/chiều rộng hạt phấn trung bình - Tỷ lệ hữu dục (%) = (Số hạt phấn hữu dục /tổng số hạt phấn theo dõi) x 100 - Tỷ lệ hạt phấn nảy mầm (%) = (Số hạt phấn nảy mầm /tổng số hạt phấn theo dõi) x 100
- Chiều dăi ống phấn trung bình (µm) = Tổng chiều dăi ống phấn/số hạt phấn theo dõi
- Tỷ lệ hạt phấn chết (%) = (Số hạt phấn chết /tổng số hạt phấn theo dõi) x 100.
3.5.2. Lai hữu tính tạo quần thể lai
Trong giai đoạn nghiín cứu của đề tăi, tiến hănh lai hữu tính 14 tổ hợp: âp dụng phương phâp lai đơn ngẫu nhiín trong câc mẫu giống bố/mẹ được chọn, mỗi tổ hợp lai tiến hănh lai 10 hoa. Định hướng lai tạo: giống mới có mău sắc đẹp, cănh hoa dăi > 100 cm, số hoa/cănh > 12 hoa, ít mẫn cảm với khô đầu lâ.
Bảng 3.3. Danh sâch câc tổ hợp lai hoa lay ơn đƣợc thực hiện
TT ♀ ♂ Kí hiệu TT ♀ ♂ Kí hiệu 1 GL1 GL2 15A01 8 GL6 GL1 15A08 2 GL2 GL1 15A02 9 GL3 GL1 15A09 3 GL2 GL3 15A03 10 GL3 GL2 15A10 4 GL2 GL7 15A04 11 GL3 GL7 15A11 5 GL2 GL10 15A05 12 GL7 GL1 15A12 6 GL2 GL6 15A06 13 GL7 GL2 15A13 7 GL6 GL2 15A07 14 GL1 GL20 15A14
Câch tiến hănh: trước khi lai 2 - 3 ngăy, bao phấn từ hoa bố được thu vă bảo quản trong hộp petri ở điều kiện thường, khô, thoâng, không có ânh sâng trực
tiếp vă gió. Sau khoảng 2 ngăy bao phấn khô vă bung phấn, tiến hănh kiểm tra độ hữu dục của hạt phấn bằng dung dịch KI - I2 1%. Trín cđy mẹ, chọn câc hoa có cânh nở 1/3 trín cđy mẹ, tiến hănh khử đực văo chiều hôm trước ngăy định tiến hănh lai vă bao câch ly. Tiến hănh thụ phấn văo buổi sâng, khô sương, khi đầu nhụy mở vă tiết dịch. Dùng chổi lông lấy phấn bố vă chấm kín văo đầu nhụy của hoa mẹ. Sau đó bao câch ly vă ghi tổ hợp lai, ngăy lai.
3.5.3. Phương phâp đânh giâ, chọn lọc dòng lai
3.5.3.1. Phương phâp đânh giâ câ thể trong quần thể lai
Âp dung theo phương phâp chọn giống đối với những cđy sinh sản vô tính Chahal & Gosal (2004): Từng hạt đơn của từng tổ hợp được gieo riíng trong vườn chọn lọc vă mỗi hạt được trồng vă đânh giâ qua 3 vụ: củ bi, củ nhỡ vă củ thương phẩm. Trong quâ trình năy, câc củ giống của từng câ thể tạo ra qua sinh sản vô tính được trồng riíng thănh từng hăng gọi lă dòng lai. Câc dòng lai được săng lọc thông qua hình thâi đâp ứng tính trạng mục tiíu để chọn lọc dòng lai ưu tú.
Theo dõi câc chỉ tiíu về sinh trưởng, chất lượng hoa. Mô tả câc đặc điểm về hình thâi: dựa theo Quy phạm khảo nghiệm tính khâc biệt, tính đồng nhất vă tính ổn định của hoa lay ơn - UPOV 2013.
Phđn cấp sđu bệnh hại cđy theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương phâp điều tra phât hiện dịch hại cđy trồng QCVN01-38:2010/BNNPTNT.
3.5.3.2. Phương phâp chọn dòng ưu tú theo mục tiíu
25 dòng lai lay ơn ưu tú được so sânh với đối chứng lă giống lay ơn Đỏ 09 (giống được Bộ NN&PTNT công nhận lă giống chính thức năm 2012). Câc giống được bố trí trong khối ngẫu nhiín đầy đủ với 3 lần nhắc lại. Mỗi giống trồng 100 củ/lần lặp, củ giống có chu vi 10-12cm đê được xử lý phâ ngủ.
Câc dòng ưu tú được chọn lọc theo chỉ số được tính toân trín phần mềm