4.3.1. Xâc định hóa chất khử trùng phù hợp nhất cho mẫu cấy
Trong quâ trình nuôi cấy in vitro, mẫu cấy vô trùng lă điều kiện bắt buộc, quyết định thănh công của thí nghiệm. Việc khử trùng phải đảm bảo tỷ lệ nhiễm thấp, đồng thời tỷ lệ mẫu tâi sinh cao, mô tồn tại được vă phât triển tốt. Hầu hết câc nghiín cứu nhđn giống in vitro lay ơn trín thế giới, hóa chất khử trùng được lựa chọn lă HgCl2 0,08 - 0,1% trong thời gian 10 phút (Priyakumari & Sheela, 2005; Kabir & cs., 2014; Kumar & cs., 2018; Devi & cs., 2019) hiệu quả mẫu sạch đạt cao, tuy nhiín loại hóa chất năy không an toăn cho người vă môi trường. Ở thí nghiệm năy, câc loại hóa chất được lựa chọn lă H2O2, Javen vă NADCC lă những chất khử trùng có mức độ an toăn cao. Kết quả thí nghiệm thu được qua bảng 4.43.
Tỷ lệ mẫu bị nhiễm ở tất cả câc công thức tương đối thấp từ 6,67 - 23,33%. Sử dụng hoạt chất NADCC 1% có tỷ lệ mẫu bị nhiễm ở mức thấp nhất, tiếp đến lă sử dụng H2O2 10% khử trung kĩp trong thời gian 15 phút.
Đối với cùng một hoạt chất khử trùng H2O2 10%, khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu nhiễm vă tỷ lệ mẫu hóa nđu giảm xuống đâng kể. Cụ thể tỷ lệ hóa nđu ở CT2 chiếm 33,33%, trong khi đó CT1 vă CT3 chỉ có 20%.
Bảng 4.36. Ảnh hƣởng của hóa chất khử trùng mẫu cấy đến khả năng tâi sinh chồi của dòng lai J11 (sau 4 tuần nuôi cấy)
CTTN Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu hóa nđu (%) Tỷ lệ mẫu không phản ứng (%) Tỷ lệ mẫu tâi sinh (%) CT1 10,00 20,00 6,67 63,33 CT2 23,33 33,33 10,00 33,33 CT3 16,67 20,00 16,67 46,67 CT4 13,33 10,00 26,67 50,00 CT5 6,67 13,33 3,33 76,67
Ghi chú: Môi trường nền MS + 3% Sucrose + 1 mg/l BAP. CT1: H2O2 10% lần 1 trong 10 phút, lần 2 trong 5 phút, CT2: H2O2 10% trong thời gian 10 phút, CT3: H2O2 10% trong thời gian 15 phút, CT4:
Javen 5,7% trong thời gian 15 phút, CT5: NaDCC 1% trong thời gian 15 phút
Đối với CT1 vă CT3 ở cùng một thời gian xử lý 15 phút, hiệu quả lăm sạch mẫu của CT1 (khử trùng kĩp) tốt hơn với tỷ lệ mẫu không phản ứng thấp 6,67%.
Trong khi đó ở CT3 thời gian mẫu ngđm liín tục kĩo dăi lăm cho hóa chất khử trùng thẩm thấu văo trong mô, gđy chết mẫu đạt 16,67%.
Sử dụng Javen 5,7% trong 15 phút có tâc dụng khử trùng bề mặt khâ tốt, tỷ lệ mẫu nhiễm vă hóa nđu tương ứng lă 13,33% vă 10%. Tuy nhiín số mẫu không có khả năng tâi sinh lại cao nhất 26,67%.
Như vậy, khử trùng mẫu cấy với NADCC1% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu tâi sinh cao nhất 76,67%, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp 6,67%.
4.3.2. Xâc định loại mẫu cấy thích hợp cho giai đoạn văo mẫu
Một dòng lai hoa lay ơn mới được tạo ra từ phĩp lai hữu tính sau khi trải qua 3 vụ từ gieo hạt đến củ bi, củ nhỡ vă củ thương phẩm sẽ có số lượng vật liệu ban đầu tương đối ít. Trong đó có củ to với đường kính từ 3 – 4 cm vă câc củ con với đường kính dao động từ 0,5 – 2 cm. Với mục đích tạo ra được nhiều mẫu cấy mă không lăm mất đi vật liệu ban đầu, chúng tôi tiến hănh xâc định chủng loại mẫu cấy thích hợp nhất để nhđn nhanh dòng lai hoa lay ơn J11 dựa trín hai đường hướng tâi sinh của mô tế băo: trực tiếp từ chồi chính, chồi bín vă giân tiếp từ lât cắt củ.
Bảng 4.37. Ảnh hƣởng của chủng loại mẫu cấy đến khả năng tâi sinh chồi của dòng lai J11 (sau 4 tuần nuôi cấy)
CTTN Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu hóa nđu (%) Tỷ lệ mẫu không phản ứng (%) Tỷ lệ mẫu tâi sinh chồi (%) Thời gian PSHT (ngăy) Số chồi/mẫu (chồi) Đặc điểm chồi/mẫu phât sinh
CT1 26,7 16,7 0,0 60,0 10,5 4,3 ± 1,01a Chồi mập, xanh đậm CT2 13,3 6,7 16,7 63,3 21,7 1,1 ± 0,65b Chồi nhỏ, xanh nhạt CT3 10,0 13,3 0,0 76,7 12,3 4,5 ± 1,24a Chồi mập, xanh đậm CT4 10,0 6,7 26,7 56,7 15,1 1,2 ± 0,76b Chồi nhỏ, xanh đậm CT5 6,7 10,0 23,3 60,0 13,5 1,1 ± 0,84b Chồi nhỏ, xanh đậm CT6 23,3 63,3 13,4 0 35,3 0 Xuất hiện callus vă lâ CT7 16,7 66,7 16,6 0 38,5 0 Xuất hiện callus vă lâ
CV (%) 7,1
LSD0,05 0,62
Ghi chú: CT1: Chồi chính của củ đường kính 3 – 4 cm;CT2: Chồi bín của củ đường kính 3 – 4 cm;CT3: Chồi chính của củ đường kính 1,5 – 3 cm;CT4: Chồi chính của củ đường kính 0,5 - 1,5 cm;CT5: Chồi chính của củ đường kính < 0,5 cm;CT6: Lât cắt của củ đường kính 3 – 4 cm;CT7: Lât cắt của củ đường kính 1,5 - 3 cm
Tỷ lệ mẫu nhiễm dao động từ 6,7 - 26,7%. Sử dụng mẫu cấy lă củ con (CT3,CT4, CT5) cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp 6,7 - 10%.Tỷ lệ mẫu nhiễm đạt cao khi sử dụng chồi chính của củ có đường kính 3 - 4cm vă lât cắt của củ lần lượt lă 26,7% vă 23,3% (Bảng 4.37).
Mẫu cấy lă lât cắt củ sản sinh ra nhiều hợp chất thứ cấp lăm cho mẫu bị hóa nđu, tỷ lệ năy đạt từ 63,3 - 66,7% ở 2 công thức CT6 vă CT7. Câc công thức còn lại tỷ lệ mẫu hóa nđu chỉ từ 6,7 - 16,7%.
Tỷ lệ mẫu không phản ứng ở mức thấp với tất cả câc công thức 0 - 26,7%. Tuy nhiín đối với CT6 vă CT7 mẫu cấy chỉ phât sinh callus vă thể dạng lâ
Khả năng tâi sinh của mẫu đạt tương đối cao từ 56,7 - 76,7% ở câc công thức sử dụng chồi chính vă chồi bín. Thời gian phât sinh chồi ở câc công thức sử dụng chồi chính khoảng 10 - 15 ngăy. Bật chồi sớm nhất lă CT1 mẫu cấy lă chồi chính của củ đường kính 3 – 4 cm với 10,5 ngăy. Trong khi đó câc mẫu cấy sử dụng lât cắt củ phải cần 35 - 38 ngăy để hình thănh callus.
Đối với mẫu cấy lă chồi bín vă câc củ có kích thước nhỏ, số lượng chồi tạo ra ít từ 1 - 2 chồi. Hai công thức còn lại sử dụng chồi chính thì ngoăi chồi chính mọc ra, xung quanh xuất hiện thím nhiều chồi kích thước nhỏ do đó số chồi mới tạo ra ở CT1 vă CT3 lần lượt lă 4,3 - 4,5 chồi/mẫu cấy.
Điều năy tương đồng với nghiín cứu của Priykamari and Sheela (2005) nín sử dụng mẫu cấy lă chồi của củ con có đường kính 0,8 - 2,1 cm. Chồi đỉnh có nhiều tế băo đang phđn chia, việc bổ sung chất kích thích sinh trưởng sẽ góp phần tạo ra nhiều chồi mới hơn.
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
(a)chồi chính của củ có đường kính 3 - 4 cm, (b)chồi bín của củ có đường kính 3 – 4 cm, (c) chồi chính của củ có đường kính 1,5 – 3 cm, (d) chồi chính của củ có đường kính 0,5 - 1,5 cm, (e) chồi chính của củ
có đường kính < 0,5 cm, (f) lât cắt của củ có đường kính 3 – 4 cm
Hình 4.17. Khả năng phât sinh hình thâi ở câc chủng loại mẫu cấy khâc nhau của dòng lai lay ơn J11
Về chất lượng chồi, câc chồi mới tạo ra từ mẫu cấy chồi đỉnh có chất lượng tốt hơn chồi mập vă mău xanh đậm
Tóm lại, Sử dụng mẫu cấy lă chồi đỉnh của củ có đường kính 1,5 – 3 cm cho tỷ lệ nhiễm thấp 10%, tỷ thời gian phât sinh chồi nhanh, số chồi trung bình tạo ra lă 4,5 chồi/mẫu.
4.3.3. Xâc định môi trường thích hợp cho giai đoạn nhđn nhanh
Với mục đích tạo cụm chồi từ mắt ngủ, việc cảm ứng ngủ nghỉ đóng vai trò rất quan trọng. Nhiều nghiín cứu cho thấy câc chất điều tiết sinh trưởng lă nhđn tố thiết yếu trong cảm ứng ngủ nghỉ. Mối tương tâc giữa auxin vă cytokinin đối với sự hình thănh chồi lay ơn được chúng tôi tiến hănh giữa tỷ lệ BAP vă α-NAA khâc nhau.
Bảng 4.38. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP/ α-NAA đến khả năng nhđn nhanh chồi hoa lay ơn (sau 6 tuần nuôi cấy)
CTTN Thời gian phât sinh chồi (ngăy) Tỷ lệ mẫu hình thănh chồi (%) Tỷ lệ biến dị (%) Số chồi/mẫu (chồi) Đƣờng kính chồi (cm) Hình thâi
CT1 13,2 83,3 0,0 3,3 ± 0,84e 0,26 ± 0,01a Chồi mập, xanh đậm CT2 16,5 66,7 6,7 2,1 ± 1,04fg 0,22 ± 0,02a Chồi trung bình,
xanh nhạt
CT3 23,5 43,3 16,7 1,2 ± 0,89gh 0,14 ± 0,02c Chồi nhỏ, xanh nhạt CT4 12,6 80,0 0,0 4,8 ± 1,21d 0,25 ± 0,02a Chồi mập, xanh đậm CT5 16,9 70,0 10,0 6,1 ± 1,01c 0,19 ± 0,02b Chồi nhỏ, xanh đậm
CT6 17,1 56,7 23,3 2,7 ± 1,24ef 0,14 ± 0,01c
Chồi nhỏ, xanh nhạt, xuất hiện biến dị dạng lâ
CT7 12,7 70,0 13,3 19,3 ± 2.2a 0,12 ± 0,02c Chồi nhỏ, yếu, trắng xanh CT8 15,4 43,3 26,7 12,1 ± 1,98b 0,12 ± 0,01c Chồi nhỏ, yếu, trắng xanh CT9 19,5 36,7 43,3 0,8 ± 0,67h 0,11 ± 0,01c Chồi nhỏ, yếu, trắng xanh, xuất hiện biến dị dạng lâ vă callus
CV (%) 6,1 8,6
LSD0,05 1,21 0,03
Ghi chú: CT1: MS + 1mg/l BAP + 0,25mg/l α-NAA; CT2: MS + 1mg/l BAP + 0,5mg/l α-NAA; CT3: MS + 1mg/l BAP+ 0,75mg/l α-NAA; CT4: MS + 2mg/l BAP + 0,25mg/l α-NAA; CT5: MS + 2mg/l BAP
+ 0,5mg/l α-NAA; CT6: MS + 2mg/l BAP + 0,75mg/l α-NAA; CT7: MS + 3mg/l BAP + 0,25mg/l α- NAA; CT8: MS + 3mg/l BAP + 0,5mg/l α-NAA; CT9: MS + 3mg/l BAP + 0,75mg/l α-NAA.
Thời gian phât sinh chồi rất sớm ở CT1, CT4 vă CT7 lă 12,6 - 12,7 - 13,2 ngăy, dăi nhất ở CT3 lă 23,5 ngăy, câc công thức còn lại dao động từ 15,4 - 19,5 ngăy. Ở cùng nồng độ BAP, thời gian phât sinh chồi dăi hơn khi tăng nồng độ α- NAA. Mặt khâc ở câc công thức BAP khâc nhau cần thời gian tương đương nhau để hình thănh chồi.
Tỷ lệ phât sinh chồi ở câc công thức có nồng độ BAP từ 1 - 2 mg/l lă khâ cao khoảng 43,3 - 83,3%. Tuy nhiín tăng nồng độ α-NAA thì tỷ lệ năy giảm dần, xuất hiện nhiều biến dị dạng lâ vă callus. Cụ thể CT1, CT2, CT3 (cùng nồng độ BAP vă tăng α-NAA) có tỷ lệ hình thănh chồi lă 83,8; 66,7; 43,3% vă tỷ lệ biến dị tương ứng lă 0; 6,7; 16,7%. Như vậy nồng độ auxin α-NAA thấp cho kết quả tạo chồi từ mắt ngủ cao hơn.
(a) 1 mg/lBAP – 0,25/0,5/0,75 mg/l αNAA (d) 0,25 mg/l αNAA – 1/2/3 mg/l BAP
(b) 2 mg/lBAP – 0,25/0,5/0,75 mg/l αNAA (e) 0,5 mg/l αNAA – 1/2/3 mg/l BAP
(c) 3 mg/lBAP – 0,25/0,5/0,75 mg/l αNAA (f) 0,75 mg/l αNAA – 1/2/3 mg/l BAP
Hình 4.18. Khả năng nhđn nhanh tạo cụm chồi của dòng lai lay ơn J11 trín câc môi trƣờng khâc nhau
Việc tăng hăm lượng Xytokinin lăm tăng số lượng chồi/mẫu đê được công bố trong câc nghiín cứu của Priyakumari & Sheela (2005), Memon & cs. (2014), Tripathi & cs. (2017) vă Devi & cs. (2019). Trong nghiín cứu năy số chồi/mẫu nhiều nhất ở CT7 lă 19,3 chồi. Hăm lượng BAP cao kích thích mẫu phât sinh nhiều chồi nhưng chồi nhỏ, đường kính chồi 0,12 cm, yếu, mău trắng xanh. Đồng thời tăng cả lượng α-NAA lăm cho mẫu cấy phât sinh nhiều thể không định hình (callus), không hình thănh chồi hoặc số lượng ít.Xĩt về chất lượng chồi thì CT1 vă CT4 ở mức tương đương nhau: Chồi xanh, mập, đường kính 0,25 - 0,26 cm. Tuy nhiín số chồi phât sinh ở CT4 nhiều hơn CT1 tương ứng lă 4,8 vă 3,3 chồi.
Như vậy công thức tốt nhất cho sự tạo chồi từ mắt ngủ lă: MS + 3% sucrose + 2 mg/l BAP + 0,25 mg/lα-NAA. Với tỷ lệ mẫu tạo chồi lă 80%, số chồi/mẫu lă 4,8 chồi.
4.3.4. Xâc định môi trường tạo củ thích hợp
Đê có nhiều bâo câo về ảnh hưởng của IBA lín khả năng tạo củ của những giống lay ơn khâc nhau, Memon & cs. (2014) đê kết luận môi trường MS bổ sung 1 mg/l IBA vă 5% sucrose có tâc dụng tốt nhất cho sự hình thănh củ lay ơn in vitro. Nghiín cứu của Dương Tấn Nhựt & cs.(2007) trín giống lay ơn mău hồng san hô cũng cho thấy sử dụng IBA ở nồng độ 0,375 mg/l có ảnh hưởng tốt lín sự hình thănh củ in vitro.
Bằng thực nghiệm nhđn giống câc giống lay ơn thương phẩm cho thấy câc giống khâc nhau có phản ứng khâc nhau với môi trường tạo củ lay ơn. Do đó, ở thí nghiệm năy câc nồng độ IBA vă hai loại môi trường nền được khảo sât để tìm ra môi trường thích hợp nhất cho khả năng tạo củ lay ơn in vitro dòng lai J11.
Kết quả từ bảng 4.39 cho thấy, ở tất cả câc công thức có tỷ lệ hình thănh củ đạt cao từ 70 - 96%. Như vậy auxin IBA có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tạo củ của dòng lai J11.
Tuy nhiín khi nồng độ IBA tăng lín thì tỷ lệ tạo củ có xu hướng giảm xuống. Theo Begum & Haddiuzaman(1995) nghiín cứu sau khi hình thănh rễ, củ được tạo ra từ phần đế chồi sau 6 - 10 tuần. Do đó, chỉ cần bổ sung một lượng nhỏ auxin ngoại sinh kích thích phât sinh rễ củ văo trong môi trường. Nếu lượng auxin ngoại sinh kết hợp với auxin nội sinh tạo ra nhiều sẽ gđy ra phản ứng đối nghích, ức chế hình thănh củ.
Bảng 4.39. Kết quả tạo củ lay ơn in vitro dòng lai J11 trín câc môi trƣờng vă nồng độ IBA khâc nhau (sau 18 tuần nuôi cấy)
CTTN Tỉ lệ mẫu hình thănh củ (%) Thời gian thu hoạch (ngăy) Khối lƣợng củ (g) Đƣờng kính củ (cm) Phđn loại củ theo đƣờng kính củ(%) Loại I 1-1,5 cm Loại II 0,5-1 cm Loại III <0,5 cm CT1 93,0 102,3 0,43 ± 0,02d 0,37 ± 0,06d 0 0 100 CT2 92,7 104,5 0,55 ± 0,04c 0,48 ± 0,05c 0 11,1 88,9 CT3 88,0 111,2 0,37 ± 0,06d 0,35 ± 0,06d 0 0 100 CT4 76,0 112,5 0,37 ± 0,07d 0,22 ± 0,03e 0 0 100 CT5 70,0 103,2 0,25 ± 0,05e 0,21 ± 0,08e 0 0 100 CT6 96,0 108,4 0,57 ± 0,02c 0,61 ± 0,05b 9,5 55,4 35,1 CT7 92,0 114,7 0,77 ± 0,03a 0,78 ± 0,05a 20,5 64,8 14,7 CT8 84,7 118,5 0,67 ± 0,05b 0,65 ± 0,07ab 7 47,7 45,3 CT9 81,3 126,5 0,61 ± 0,06bc 0,62 ± 0,03b 8,4 33,5 58,1 CT10 75,3 119,3 0,55 ± 0,07c 0,61 ± 0,04b 6,1 28,2 65,7 CV% 7,24 8,11 LSD0,05 0,06 0,07
Ghi chú: CT1: ½ MS + 0,5mg/l IBA;CT2: ½ MS + 1 mg/l IBA;CT3: ½ MS + 1,5mg/l IBA;CT4: ½ MS + 2 mg/l IBA;CT5: ½ MS + 2,5mg/l IBA;CT6: MS + 0,5mg/l IBA;CT7: MS + 1 mg/l IBA;CT8: MS +
1,5mg/l IBA;CT9: MS + 2 mg/l IBA;CT10: MS + 2,5mg/l IBA
Thời gian thu hoạch củ dao động từ 102,3-126,5 ngăy. Môi trường 1/2MS có thời gian thu củ ngắn hơn từ 102,3 - 112,5 ngăy. Lượng dinh dưỡng nhiều hơn giúp cđy duy trì bộ lâ lđu vă củ cần nhiều thời gian để tăng kích thước hơn, thời gian thu hoạch củ khi sử dụng môi trường MS dao động từ 108,4 - 126,5 ngăy.
Chất lượng củ giống tạo ra chính lệch giữa hai loại môi trường nền. Sử dụng 1/2MS có trọng lượng củ trung bình từ 0,25 - 0,55 g, đường kính củ từ 0,21 - 0,48 cm. Môi trường nền MS cho củ có chất lượng củ tốt hơn với trọng lượng củ đạt từ 0,55 - 0,77 g vă đường kính củ từ 0,61 - 0,78 cm.
Củ giống in vitro được phđn loại thănh 3 nhóm tương ứng với đường kính củ từ < 0,5 cm; 0,5 – 1 cm; 1 - 1,5 cm. Môi trường nền 1/2MS cho củ con thu được có kích thước nhỏ < 0,5 chiếm từ 88,9 - 100%. Tỷ lệ củ con có đường kính 0,5 – 1 cm chiếm ưu thế ở môi trương nền MS từ 28,2 - 64,8%.
(a) (b)
(c) (d)
(a) Môi trường nền 1/2MS – 0,5/1/1,5/2/2,5mg/l IBA, (b) Môi trường nền MS – 0,5/1/1,5/2/2,5mg/l IBA, (c) Bổ sung 1mg/l IBA – Môi trường nền 1/2MS vă MS, (d) (c) Bổ sung 2,5mg/l IBA –
Môi trường nền 1/2MS vă MS
Hình 4.19. Chất lƣợng củ in vitro của dòng lai lay ơn J11 trín câc môi trƣờng tạo củ khâc nhau
Xĩt cả hai loại môi trường khi được bổ sung 1mg/l IBA cho kích thước củ con lớn hơn, tỷ lệ củ đường kính 1 - 1,5 chiếm 20,5%, củ đường kính 0,5-1cm chiếm 11,1 - 64,8%.
Như vậy, môi trường MS + 1 mg/l IBA thích hợp cho tạo củ in vitro dòng lai J11 với tỷ lệ tạo củ đạt 92%, trọng lượng củ trung bình 0,77 g, đường kính củ đạt 0,78 cm.
4.3.5. Nghiín cứu ảnh hưởng của chế độ chiếu sâng đến khả năng tạo củ vă chất lượng củ của dòng lai J11