5. Ý ngh ĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài
2.4.7. Phương pháp xác định hàm lượng độc tố vin ấm Aflatoxins
a. Nguyên tắc
Mẫu được chiết bằng dịch chiết bằng hỗn hợp dung môi MeOH : H2O (7:3), dịch chiết được pha loãng và làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch Aflatest. Aflatoxins trong mẫu được định danh và định lượng trên LC/MS/MS.
b. Hóa chất, hóa chất chuẩn
- Hóa chất
+ Acetonitril (ACN), loại sử dụng cho HPLC. + Methanol loại sử dụng cho HPLC.
+ Formic acid (FA) loại sử dụng cho HPLC. + Nước khử ion (lọc qua màng lọc 0,45 µm). + NaCl (tinh khiết phân tích).
+ Dung môi chiết: MeOH: H2O (7:3): Trộn 70 mL MeOH và 30 mL H2O theo thể tích.
- Hóa chất chuẩn
Pha các dung dịch chuẩn Aflatoxin B1, B2, G1, G2 sử dụng dựng đường chuẩn có nồng độ 0,6; 1,2; 3,0; 6,0 mg/L. c. Thiết bị và dụng cụ - Thiết bị + Máy lắc. + Cân phân tích 4 số lẻ. + Máy vortex. + Hệ thống thổi khí bằng nitơ. + Máy ly tâm lạnh.
+ Cột ái lực Aflastar (IAC column), hãng sản xuất Romer Labs, Mỹ hoặc tương đương.
+ Hệ thống chiết pha rắn SPE.
+ Máy sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS, với điều kiện sắc ký
ØCột pha đảo C8, 100 mm x 2.1 mm x 1.8 mm.
ØDetector MS/MS-ESI
Tên chất Ion mẹ Ion con 1 Ion con 2 Cực Aflatoxin G2 331 313 245 Dương Aflatoxin G1 329 311 243 Dương Aflatoxin B2 315 259 287 Dương Aflatoxin B1 313 241 213 Dương Thể tích tiêm: 5 µL. Ø Nhiệt độ buồng cột: 40 0C. Ø Điều kiện pha động: Thời gian (phút) Kênh A (MeOH) Kênh B 0,05%FA trong ACN C (Nước DI) Tốc độ dòng (mL/min) 0 10 30 60 0,2 0,2 10 30 60 0,2 9,0 10 70 20 0,2 9,1 10 30 60 0,2 13 10 30 60 0,2
Hình 2.6. Máy LC/MS/MS xác định hàm lượng Aflatoxins
- Dụng cụ
+ Pipet thủy tinh 1, 2, 5, 10 mL.
+ Pipet piston: 10÷100 mL, 20÷200 mL, 100÷1000 mL; 1000÷5000 mL. + Bình định mức thủy tinh 10, 25 mL.
+ Bình tam giác nút mài 250 mL. + Ống thủy tinh 10 mL.
d. Cách tiến hành
- Chiết mẫu
+ Cân khoảng 20 g (M) (chính xác đến 0.001 g) mẫu thử đã đồng nhất vào bình tam giác 250 mL.
+ Thêm 5 g NaCl.
+ Thêm 100 mL (V1) hỗn hợp dịch chiết MeOH : H2O (7:3).
+ Đậy kín nắp, lắc trên máy lắc khoảng 30 phút, lấy ra, để lắng, chuyển lớp dung môi chiết ra ống ly tâm 50 mL, ly tâm trong 10 phút, 4000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Hút 10 mL (V2) dịch chiết sau ly tâm vào ống 50 mL, thêm 20 mL nước cất, lắc đều. (V3 = 30 mL), lắc đều.
- Làm sạch
+ Cột được đểổn định đến nhiệt độ phòng.
+ Rửa cột bằng 10 mL nước cất, không để khô cột.
+ Chuyển 15 mL (V4) mẫu qua cột với tốc độ khoảng 2 giọt/giây. Lưu ý: không để cột khô trong quá trình chuyển dịch chiết qua cột. + Rửa cột: Rửa cột bằng 15 mL nước.
+ Hút khô cột bằng bơm chân không 5 - 10 giây. - Rửa giải
+ Chuyển 1,5 mL MeOH lên cột (đã khoá van xả) đợi 3 phút, mở van xả,
điều chỉnh tốc độ rửa giải 1 - 2 mL/phút. Aflatoxin được rửa giải vào ống nghiệm, thổi khô dịch rửa giải bằng khí N2 ở 40 - 50 oC.
+ Hoà tan cặn bằng 1 mL (Vdm) hỗn hợp dung môi ACN : H2O (1:9), chuyển dịch chiết vào lọ thủy tinh 2 mL, định danh và định lượng trên hệ
thống LC/MS/MS.
đ. Xây dựng đường chuẩn, đo mẫu
- Xây dựng đường chuẩn
Tiêm các dung dịch chuẩn vào máy, dựng đường chuẩn trên phần mềm thiết bị.
- Đo mẫu
Tiêm mẫu vào thiết bị, định danh các chất Aflatoxin B1, B2, G1, G2 dựa vào thời gian lưu của các píc, các mảnh ion.
e. Tính kết quả
- Hàm lượng của Aflatoxin B1, B2, G1, G2 có trong mẫu X (mg/kg)
được tính theo công thức:
M V V V V V C X 4 2 dm 3 1 m ´ ´ ´ ´ ´ =
Trong đó:
ØCm: hàm lượng Aflatoxins có trong mẫu đo được trên máy (mg/L);
ØVdm: thể tích định mức của mẫu (mL);
ØV1, V2, V3, V4: Các thể tích dịch chiết (mẫu) (mL);
ØM: Khối lượng mẫu lấy để thử nghiệm (g).
Phương pháp này sử dụng để xác định hàm lượng Aflatoxins trong bột TQM.