5. Ý ngh ĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài
2.8.2. Phân tích cao chiết DCM
Tiến hành sắc ký cột với cao chiết DCM (4,2670 g), sử dụng cột sắc ký thủy tinh 20 mm x 600 mm, hạt nhồi là silica gel G cỡ hạt 63-200 μm Merck 50 g. Hệ dung môi giải ly H : A (theo tỷ lệ có độ phân cực tăng dần từ 5:1 đến 1:3) thu được 8 phân đoạn (xem hình 2.11).
Hình 2.11. Sắc ký cột cao chiết DCM
Dựa trên sắc ký lớp mỏng, các lọ cho các vết giống nhau về màu sắc và giá trị Rf trên cùng sắc ký đồ được gộp chung lại. Tất cả gộp thành 8 phân
đoạn (DCM G1 đến DCM G8) được nêu trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các phân đoạn cao chiết DCM
Phân đoạn Các lọđược gộp Ký hiệu Khối lượng (mg) 1 1 - 3 DCM G1 3,1 2 4 - 8 DCM G2 25,4 3 9 - 15 DCM G3 482,3 4 16 - 50 DCM G4 988,7 5 51 – 65 DCM G5 237,7 6 65 - 76 DCM G6 356,5 7 77 -84 DCM G7 316,4 8 85 -100 DCM G8 331,2
a. Tiến hành khảo sát phân đoạn DCM G3 (482,3 mg)
Tiến hành sắc ký cột với phân đoạn DCM G3 (482,3 mg), sử dụng cột sắc ký thủy tinh 10 mm x 800 mm, hạt nhồi là silica gel G cỡ hạt 63- 200 μm Merck và hệ dung môi giải ly H:A (theo tỷ lệ có độ phân cực tăng dần từ 12:1 đến 5:1), thu được 60 lọ (15 mL/lọ). Dựa trên sắc ký lớp mỏng, các lọ có các vết giống nhau về màu sắc và giá trị Rf trên cùng sắc ký đồ được gộp chung lại. Tất cả có 5 phân đoạn (DCM G3-1 đến DCM G3-5) như sau: DCM G3-1 (lọ 1-14), DCM G3-2(lọ 15-26), DCM G3-3 (lọ 27- 35), DCM G3-4 (lọ 36-52), DCM G3-5 (lọ 53-60). Trong đó phân đoạn DCM-G3-1 sau khi kết tinh trong H, chạy sắc ký lớp mỏng chỉ cho một vết rõ, thu được hợp chất ký hiệu DCM-G3-1 (25,4 mg; dạng bột, màu vàng nhạt), theo sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn DCM-G3 (xem hình 2.12).
Hình 2.12. Sơđồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn DCM G3
b. Tiến hành khảo sát phân đoạn DCM G4 (988,7 mg)
Tiến hành sắc ký cột với phân đoạn DCM G4 (988,7 mg), sử dụng cột sắc ký thủy tinh 10 mm x 800 mm, hạt nhồi là silicagel G cỡ hạt 63- 200 μm Merck và hệ dung môi giải ly H:A (theo tỷ lệ có độ phân cực tăng
DCM-G3 (482,3 mg) Sắc ký cột, hệ dung môi giải ly H:A (có tỷ lệ từ 12:1 đến 5:1) DCM G3-2 (22,4 mg) DCM G3-1 (25,4 mg) DCM G3-5 (18,7 mg) DCM G3-3 (34,1 mg) DCM G3-4 (36,3 mg)
dần từ 10:1 đến 4:1), thu được 65 lọ (15 mL/lọ). Dựa trên sắc ký lớp mỏng, các lọ có các vết giống nhau về màu sắc và giá trị Rf trên cùng sắc ký đồ được gộp chung lại. Tất cả có 6 phân đoạn (DCM G4-1 đến DCM G4-6) như sau: DCM G4-1 (lọ 1-3), DCM G4-2(lọ 4-10), DCM G4-3 (lọ 11-25), DCM G4-4 (lọ 26-37), DCM G4-5 (lọ 38-55), DCM G4-6 (lọ 56-65). Trong đó phân đoạn DCM-G4-3 sau khi kết tinh trong H, chạy sắc ký lớp mỏng chỉ cho một vết rõ, thu được hợp chất ký hiệu DCM-G4-3 (87,6 mg; dạng bột, màu vàng) theo sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn DCM- G4 (xem hình 2.13).
Hình 2.13. Sơđồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn DCM G4
c. Tiến hành khảo sát phân đoạn DCM G4-5 (325,1 mg)
Tiến hành sắc ký cột với phân đoạn DCM G4-5 (325,1 mg), sử dụng cột sắc ký thủy tinh 10 mm x 800 mm, hạt nhồi là silicagel G cỡ hạt 63-200
μm Merck và hệ dung môi giải ly H:A (theo tỷ lệ có độ phân cực tăng dần từ 12:1 đến 7:1), thu được 57 lọ (15 mL/lọ). Dựa trên sắc ký lớp mỏng, các lọ
có các vết giống nhau về màu sắc và giá trị Rf trên cùng sắc ký đồ được gộp chung lại. Tất cả có 5 phân đoạn (DCM G4-5-1 đến DCM G4-5-5) như sau:
DCM G4 (988,7 mg) DCM G4-1 (12,4 mg) DCM G4-2 (15,4 mg) DCM G4-3 (87,6 mg) DCM G4-4 (254,4 mg) DCM G4-5 (325,1 mg) DCM G4-6 (125,8 mg) Sắc ký cột, hệ dung môi giải ly H:A (có tỷ lệ từ 10:1 đến 4:1)
DCM G4-5-1 (lọ 1-8), DCM G4-5-2 (lọ 9-15), DCM G4-5-3 (lọ 16-30), DCM G4-5-4 (lọ 31-46), DCM G4-5-5 (lọ 47-57). Trong đó phân đoạn DCM-G4-5-2 sau khi kết tinh trong H, chạy sắc ký lớp mỏng chỉ cho một vết rõ, thu được hợp chất ký hiệu DCM-G4-5-2 (42,4 mg; dạng bột, màu vàng) theo sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn DCM-G4-5 (xem Hình 2.14).
Hình 2.14. Sơđồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn DCM G4-5
Để xác định cấu trúc các hợp chất DCM G3-1, DCM G4-3 và DCM G4-5-2 đã phân lập được, tiến hành phân tích và ghi các phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT trên máy cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), kiểu Ultrashield 500 Plus, hãng sản xuất BRUKER. DCM-G4-5 (325,1 mg) Sắc ký cột, hệ dung môi giải ly H:A (có tỷ lệ từ 12:1 đến 5:1) DCM G4-5-1 (5,7 mg) DCM G4-5-5 (48,7 mg) DCM G4-5-2 (42,4 mg) DCM G4-5-3 (38,1 mg) DCM G4-5-4 (36,3 mg)
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 3.1.1. Độẩm
Tiến hành xác định độ ẩm của mẫu hạt TQM theo mục 2.4.1. Kết quả được nêu trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độẩm của mẫu hạt TQM ST T m2 (g) m1 (g) m3 (g) w (%) 1 11,2287 45,6651 55,9381 8,550 2 10,9650 44,5974 54,6366 8,501 3 10,0690 48,5137 57,7243 8,525 4 10,0047 45,0343 54,1859 8,528 5 10,2131 47,2134 56,5573 8,511 6 10,3168 43,2954 52,7332 8,520 Độẩm trung bình 8,52 Nhận xét: Không có một dược liệu nào đạt độ khô tuyệt đối (độ ẩm 0%), nhưng đối với mỗi dược liệu đều được quy định một độ ẩm an toàn. Ðể
bảo quản tốt, dược liệu cần có độ ẩm bằng hoặc dưới độ ẩm an toàn. Hạt TQM chưa có quy định độ ẩm an toàn. Tuy nhiên, so sánh với độ ẩm an toàn của một số dược liệu trong khoảng từ 9% đến 12% (theo Dược điển Việt Nam IV) thì hạt TQM có độ ẩm xác định được là đạt yêu cầu. Với giá trị độ ẩm trung bình 8,52%, hạt TQM có khả năng bảo quản trong thời gian dài mà không bị hư hỏng, giữ được chất lượng trong quá trình làm thử nghiệm.
3.1.2. Tro toàn phần
Kết quả được nêu trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả xác định tro toàn phần trong mẫu hạt TQM
STT m1 m2 (g) m3 (g) H (%) Htb (%) 1 32,6671 5,0125 32,9422 5,488
5,49
2 35,9078 5,0244 36,1837 5,491 3 34,2575 5,0096 34,5331 5,501
Nhận xét: Kết quả trên bảng 3.2 cho thấy hàm lượng tro trong mẫu trung bình 5.49% . Như vậy, các tạp chất không tan tương đối lớn, điều này dự báo cho thấy hàm lượng kim loại nặng là đáng kể trong mẫu hạt thảo quyết minh, tuy nhiên so với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam quy định thì hàm lượng tro toàn phần không vượt quá 20% là đạt tiêu chuẩn.
3.1.3. Hàm lượng kim loại
Tiến hành xác định hàm lượng kim loại trong mẫu hạt TQM theo mục 2.4.3; 2.4.4; 2.4.5 và 2.4.6. Kết quảđược nêu trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng kim loại trong mẫu hạt TQM [phụ lục 1]
STT Kim loại Kết quảđo được (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) 1 As KPH(<0,05) 1,0 2 Hg KPH(<0,05) 0,05 3 Sb KPH(<0,05) 1,0 4 Pb KPH(<0,05) 2,0 5 Cu 5,82 30 6 Zn 35,1 40 7 Cd KPH(<0,05) 1,0 8 Sn KPH(<0,05) 50
Nhận xét: Thành phần kim loại nặng có trong hạt TQM đa số là không phát hiện (nhỏ hơn giới hạn phát hiện của phương pháp), chỉ có Cu là 5,82 mg/kg và Zn là 35,1 mg/kg, trong đó hàm lượng Zn tương đối lớn. Tuy nhiên, kết quả so sánh với giới hạn kim loại nặng tương ứng với chè và sản phẩm chè theo quyết định 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 thì hàm lượng các kim loại nặng trong hạt TQM nằm trong giới hạn cho phép. Đây cũng là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá việc sử dụng hạt TQM dùng làm dược liệu an toàn [5].
3.1.4. Xác định độc tố vi nấm Aflatoxins
Tiến hành xác định hàm lượng kim loại nặng trong mẫu hạt TQM theo mục 2.4.7. Kết quả thử nghiệm mẫu dịch chiết trên thiết bị LC/MS/MS được thể hiện theo hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả xác định hàm lượng Aflatoxin trong hạt TQM trên LC/MS/MS
Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng Aflatoxins trong mẫu hạt TQM STT Loại Aflatoxins Kết quả đo được (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) 1 Aflatoxin B1 KPH(<0,2) 2 2 Aflatoxin B2 KPH(<0,2) - 3 Aflatoxin G1 KPH(<0,2) - 4 Aflatoxin G2 KPH(<0,2) - 5 Aflatoxin tổng KPH(<0,8) 4
Nhận xét: Hàm lượng độc tố vi nấm trong hạt TQM không phát hiện. Kết quả so sánh quy định tại mục 1.10 - Quả khô và các sản phẩm từ quả khô được dùng để ăn, hoặc được sử dụng như một thành phần trong thực phẩm trong quy chuẩn quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm (QCVN 8-1:2011/BYT) về thì hàm lượng độc tố vi nấm aflatoxin B1 và aflatoxin tổng trong hạt TQM nằm trong giới hạn cho phép [4].
3.2. KẾT QUẢ TRÍCH LY CÁC LOẠI CAO
Tiến hành trích ly các loại cao của hạt TQM theo mục 2.5. Kết quả chiết xuất được nêu trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hiệu suất trích ly các loại cao STT Loại cao Ký hiệu Khối lượng (g) Hiệu suất (%) 1 Methanol MeOH 171,838 17,2 2 n-Hexane H 30,9738 3,10 3 Dichloromethane DCM 11,8261 1,18 4 Ethyl acetate EA 8,1201 0,81
Nhận xét: Theo bảng 3.5, trong ba loại cao chiết từ cao MeOH, cao chiết H có hiệu suất cao nhất (3,10%), cao chiết EA có hiệu suất thấp nhất 0,18%. Tuy nhiên, lượng cao chiết MeOH không bị chuyển sang các dung môi H,
DCM, EA sau khi chiết vẫn còn tương đối lớn (120,918 g). Hiệu suất chiết của 3 loại dung môi chênh lệch nhau không lớn, điều này chứng tỏ thành phần các chất trong hạt TQM được trải đều từ những chất không phân cực đến phân cực.
3.3. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC DỊCH CHIẾT 3.3.1. Thành phần hoá học các cao chiết H
Cao chiết H của hạt TQM được hòa tan lại bằng H (gọi là dịch chiết H), phân tích bằng máy sắc ký khí khối phổ. Định danh các chất trong dịch chiết H bằng cách so sánh phổ khối của phổ đồ thu được của mẫu với phổ khối chuẩn trong thư viện phổ NIST và đã định danh được một số cấu tử trong dịch chiết H, được nêu trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Một số cấu tử trong dịch chiết n-hexane
S TT
Rt (phút)
Tên hợp chất, công thức phân tử, công thức cấu tạo % Diện tích píc 1 13,355 Tetradecane, C14H30 0,21 2 18,251 Hexadecane, C16H34 0,23 3 23,267 Octadecane, C18H38 0,17
4 26,326 Hexadecanoic acid, methyl ester, C17H34O2 0,79
6 30,167 9,12-Octadecadienoic acid, methyl ester, C19H34O2 1,81
7 30,318 9-Octadecenoic acid (Z)-, methyl ester, C19H36O2 0,94
8 31,583 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-, C18H32O2 18,09
10 39,220 9,10-Anthracenedione, 1,8-dihydroxy -4-methoxy- 2-methyl-, C16H12O5 0,14 11 39.403 Cyclohexadecane, 1,2-diethyl-, C20H40 1,36 12 39.507 9,17-Octadecadienal, (Z)-, C18H32O 1,04 13 41.870 Vitamin E, C29H50O2, 1,14
14 42.889 Stigmasterol, C29H48O, 1,99
15 43.382 Isocholesteryl methyl ether, C28H48O, 5,11
Kết quả định danh và sắc ký đồ phổ GC/MS của dịch chiết H (xem chi tiết phụ lục 2 và phụ lục 3)
Nhận xét: Kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết n-hexane hạt TQM cho thấy: Trong dịch chiết n-hexane có 15 cấu tử được định danh, nếu tính theo diện tích píc thì 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)- (18,09%), n- hexadecanoic acid (15,77%), 9,12,15-Octadecatrienoic acid, (Z,Z,Z)- (11,10%), và các cấu tử còn lại chiếm tỷ lệ diện tích píc thấp. Trong đó có một số cấu tử có hoạt tính sinh học như: n-hexadecanoic acid (ức chế
enzyme), vitamin E (chống oxy hóa), Stigmasterol (chống ôxy hoá, làm giảm cholesterol trong máu), 9,10-Anthracenedione, 1,8-dihydroxy-4-methoxy- 2-methyl- (kháng nấm).
3.3.2. Thành phần hoá học các cao chiết DCM
Cao chiết DCM của hạt TQM được hòa tan lại bằng DCM (gọi là dịch chiết DCM), phân tích bằng máy sắc ký khí khối phổ. Định danh các chất trong dịch chiết DCM bằng cách so sánh phổ khối của phổ đồ thu được của mẫu với phổ khối chuẩn trong thư viện phổ NIST và đã định danh được một số cấu tử trong dịch chiết DCM, được nêu trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Một số cấu tử trong dịch chiết DCM
S TT
Rt (phút)
Tên hợp chất, công thức phân tử, công thức cấu tạo
% Diện tích píc 1 36,214 9,10-Anthracenedione, 1,8-dihydroxy -3-methyl-
,C15H10O4
3,04
2 38,827 Obtusifolin, C16H12O5 5,83
3 39,216 9,10-Anthracenedione, 1,8-dihydroxy -3-methoxy-6- methyl-, C16H12O5
4 39,300 4H-Naphtho[2,3-b]pyran-4-one, 5,6- dihy droxy-8- methoxy-2-methyl-, C15H12O5 4,51 5 41,139 Obtusin, C18H16O7 3,17 6 41,299 Aurantio – obtusin, C17H14O7 3,53 7 41,699 Eupatilin, C18H16O7 4,14 Nhận xét: Kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết DCM hạt TQM cho thấy: Định danh được 7 cấu tử. Tính theo diện tích píc thì phần lớn là các chất thuộc nhóm anthraquinones (9,10-Anthrace nedione, 1,8- dihydroxy-3-methyl-; Obtusifolin, 9,10-Anthracenedione, 1,8-dihydroxy -3- methoxy-6-methyl-; Obtusin; Aurantio – obtusin) có khả năng kháng nấm,
Eupatilin thuộc nhóm flavonoid (chống oxi hóa, ức chế phản ứng viêm). Các thành phần axít hữu cơ, các hydrocarbon không phát hiện trong dịch chiết DCM, điều này cho thấy khi chiết cao MeOH bằng dung môi n-hexan đã hòa tan một lượng lớn các hydrocarbon và axít hữu cơ, đây cũng là một trong những phương pháp tách chiết các thành phần ít phân cực như hydrocarbon và axít hữu cơ ra khỏi các chất có khả năng phân cực trung bình hoặc phân cực.
Kết quả định danh và sắc ký đồ phổ GC/MS của dịch chiết DCM (xem chi tiết phụ lục 4 và phụ lục 5)
3.3.3. Thành phần hoá học các cao chiết EA
Cao chiết EA của hạt TQM được hòa tan lại bằng EA (gọi là dịch chiết EA), phân tích bằng máy sắc ký khí khối phổ. Định danh các chất trong dịch chiết EA bằng cách so sánh phổ khối của phổ đồ thu được của mẫu với phổ
khối chuẩn trong thư viện phổ NIST và đã định danh được một số cấu tử
trong dịch chiết EA, được nêu trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Một số cấu tử trong dịch chiết EA
S TT
Rt (phút)
Tên hợp chất, công thức phân tử, công thức cấu tạo
% Diện tích píc 1 38,841 Obtusifolin, C16H12O5 1,64
2 39,313 4H-Naphtho[2,3-b]pyran-4-one, 5,6- dihy droxy-8- methoxy-2-methyl-, C15H12O5
Kết quả định danh và sắc ký đồ phổ GC/MS của dịch chiết H (xem chi tiết phụ lục 6 và phụ lục 7)
Nhận xét: Kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết EA hạt TQM phần lớn không định danh được bằng phương pháp GC/MS với thư viện phổ
NIST, nguyên nhân do phổ chuẩn trong thư viện chưa có những chất như
trong dịch chiết EA, chỉ định danh 2 cấu tử là Obtusifolin và 4H- Naphtho[2,3-b]pyran-4-one, 5,6-dihydroxy-8-methoxy-2-methyl-. Obtusifolin trong dịch chiết EA có phần trăm diện tích 1,64% thấp hơn so với dịch chiết DCM. Điều này cho thấy khả năng hòa tan của Obtusifolin trong dung môi EA thấp hơn so với dung môi DCM. Tương tự đối với chất 4H-Naphtho[2,3- b]pyran-4-one, 5,6- dihy droxy-8-methoxy-2-methyl-.
3.4. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Các cao chiết H, DCM và EA được thử hoạt tính kháng sinh tại phòng thử nghiệm Hóa Vi sinh, Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 2. Kết quả được nêu trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của các cao chiết hạt TQM [phụ lục 8]
Vi sinh vật kiểm định
Nồng độ ức chế > 50% sự phát triển của vi sinh vật và nấm kiểm định –IC50 (μg/ml) Cao chiết H Cao chiết DCM Cao chiết EA Gram (+) Staphylococcus Aureus 110 85,2 > 128 Gram (-) Escherichia Coli > 128 > 128 > 128 Pseudomonas aeruginosa > 128 > 128 > 128
Nhận xét: Kết quả từ bảng 3.9 hoạt tính kháng sinh của các cao chiết hạt TQM cho thấy: Cao chiết H, DCM và EA đều không có khả năng ức chế
> 50% sự phát triển của các chủng vi sinh vật Escherichia Coli, Pseudomonas aeruginosaở nồng độ > 128 μg/ml. Tương tự đối với cao chiết EA với chủng