5. Ý ngh ĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài
2.1.2. Xử lý mẫu nguyên liệu
Trái TQM sau khi hái, phơi khô, bóc vỏ, thu được hạt. Tiếp tục phơi khô hạt TQM. Xay nghiền nhỏ hạt thành bột mịn.
Hình 2.1. Hạt và bột hạt TQM 2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
- Các phổ1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, được ghi trên Máy cộng hưởng từ
- Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Agilent 7890A/5975C. Cột sắc ký HP5MS (chiều dài 30 m; đường kính trong 0,25 mm; lớp phim dày 0,25 μm);
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Zeenit 700, Analytik Jena, Đức. - Cột sắc ký thủy tinh 20 mm x 600 mm và cột 10 mm x 80 mm. Hạt nhồi là silicagel G cỡ hạt 63 - 200 μm Merck;
- Sắc ký bản mỏng: Silicagel 60 F254 Merck;
- Buồng soi UV Vilber Lourmat bước sóng 254 nm và 365 nm; - Máy xay mẫu Waring, Mỹ;
- Cân phân tích CP225D, Sartorius, Đức;
- Tủ sấy UNB400, Memmert, Đức, khoảng nhiệt độ 30 - 300 oC;
- Lò nung L5/11, Nabertherm, Đức, khoảng nhiệt độ nung 30 - 1100 oC; - Máy sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS 1290/6490, Agilent, Mỹ;
- Quang phổ hồng ngoại biến đổi fourier NICOLET iS10, Thermo Scientific, Mỹ;
- Máy lắc ngang GFL, Đức;
- Cột sắc ký: 60 x 2cm và 80 x 1cm; - Bể siêu âm Branson, Mỹ;
- Máy li tâm lạnh Hettech, Đức;
- Các dụng cụ thủy tinh: Bình thủy tinh, phễu chiết, ống đong, cốc thủy tinh ...
2.2.2. Hóa chất
Một số hóa chất thuốc thử sử dụng chính được nêu trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Hóa chất thuốc thử
STT Tên hóa chất Nước sản xuất 1 n-Hexane Trung Quốc 2 Ethyl acetate Trung Quốc 3 Dichloromethane Trung Quốc 4 Methanol Trung Quốc 5 H2SO4đậm đặc (đđ) Trung Quốc
2.3. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
Sơđồ khảo sát chỉ tiêu hóa lý và điều kiện chiết xuất
Hình 2.2. Sơđồ nghiên cứu
- Chiết với Methanol
- Lọc, cô quay thu hồi dung môi Cao Methanol thô
- Hòa tan với nước
- Chiết lần lượt với các dung môi H, DCM, EA
Các cao chiết H, DCM, EA Định danh các cấu tử trong các dịch chiết H, DCM, EA Đo GC-MS Thử hoạt tính sinh học các cao chiết H, DCM, EA Các hợp chất được phân lập và tinh chế từ cao DCM Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập - Sắc ký bản mỏng - Sắc ký cột Đo phổ IR, H1-NMR, C13-NMR, MS Dịch chiết H, DCM, EA
Lọc, cô quay, thu hồi dung môi Dịch nước Hạt thảo quyết minh (đã tách hạt, phơi khô) Xay mịn Mẫu nguyên liệu (khô) Xác định độẩm, tro tổng và hàm lượng kim loại nặng, độc tố vi nấm Aflatoxins
2.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 2.4.1. Độẩm [2] 2.4.1. Độẩm [2]
a. Nguyên tắc
Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từđó tính ra phần trăm nước có trong mẫu.
b. Dụng cụ và thiết bị
- Tủđiều chỉnh nhiệt độ (100 – 105) 0C. - Cân phân tích 4 số lẻ.
- Bình hút ẩm phía dưới chứa chất hút ẩm (silicagel). - Đĩa petri.
- Đũa thủy tinh.
Hình 2.3. Tủ sấy sử dụng để sấy mẫu xác định độ ẩm
c. Cách tiến hành
- Đĩa Petri được rửa sạch, sấy khô ở (100 – 103) 0C trong 2 giờ, lấy ra, để
nguội trong bình hút ẩm (20 - 25) phút, cân, ghi lại khối lượng đĩa (m1).
- Cân 10 g (m2) bột TQM vào 5 đĩa petri (đã biết trước khối lượng), dùng
ở nhiệt độ (100 - 103) 0C trong khoảng 5 giờ. Đậy nắp, lấy mẫu ra khỏi tủ, làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 25) phút. Cân và ghi lại khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy.
- Cho lại vào tủ sấy, sấy tiếp ở nhiệt độ (100 – 103) 0C trong 1 giờ. Lặp lại cho đến khi khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không lệch quá 0,005 g, ghi lại khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy (m3).
d. Tính toán kết quả
Độẩm theo phần trăm được tính theo công thức 100 m ) m m (m (%) ω 2 3 2 1+ - ´ = Trong đó: Øw: Hàm lượng ẩm (%); Øm1: Khối lượng đĩa petri (g);
Øm2: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g);
Øm3: Khối lượng mẫu + đĩa petri sau khi sấy (g).
Phương pháp này sử dụng để xác định độẩm mẫu bột hạt TQM. 2.4.2. Hàm lượng tro [1] a. Nguyên tắc Phá huỷ hợp chất hữu cơ bằng cách nung ở nhiệt độ (525 ± 25) oC đến khối lượng không đổi. b. Dụng cụ và thiết bị - Lò nung. - Cân phân tích 4 số lẻ.
- Bình hút ẩm phía dưới để chất hút ẩm (silicagel).
Hình 2.4. Lò nung sử dụng để xác định hàm lượng tro
c. Cách tiến hành
- Chuyển chén sứ vào lò nung, nung ở nhiệt độ (525 ± 25) oC trong 2 giờ, lấy ra, chuyển vào bình hút ẩm, để nguội trong (20 - 25) phút, cân, ghi lại khối lượng chén sứ (m1).
- Cân 5 g (m2) bột TQM vào 5 đĩa chén sứ (đã biết trước khối lượng), cho chén sứ chứa mẫu vào lò nung, nung ở nhiệt độ (525 ± 25) oC trong khoảng 5 giờ. Nung xong lấy mẫu ra khỏi lò, làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 25) phút, cân và ghi lại khối lượng chén nung và tro.
- Cho lại vào lò và nung tiếp ở nhiệt độ (525 ± 25) oC trong 1h, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 25) phút, cân và ghi lại khối lượng. Lặp lại cho đến khi khối lượng chén nung và tro (m3) giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,001 g .
d. Tính toán kết quả
Hàm lượng tro theo phần trăm được tính theo công thức 100 m ) m (m (%) H 2 1 3 - ´ =
Trong đó:
ØH: Hàm lượng tro (%);
Øm1: Khối lượng chén sứ (g);
Øm2: Khối lượng mẫu trước khi nung (g);
Øm3: Khối lượng tro + chén sứ sau khi nung (g).
Phương pháp này sử dụng để xác định hàm lượng tro của mẫu bột hạt TQM.
2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng kim loại As, Sb [16]
a. Nguyên tắc
Mẫu được vô cơ hoá bằng phương pháp khô sau đó được đo trên máy AAS - kỹ thuật đo hoá hơi.
b. Hóa chất, hóa chất chuẩn
- Hóa chất
+ Nước cất sử dụng để thử nghiệm là nước cất hai lần hoặc nước cất có
độ tinh khiết tương đương.
+ Dung dịch Mg(NO3)2 7,5%: hoà tan 7,5 g Mg(NO3)2 trong 100 mL nước cất.
+ Hỗn hợp KI 5% và axit Ascorbic 5%: Hòa tan 5 g KI và 5 g axit Ascorbic trong 100 mL nước cất. Bảo quản lạnh trong bình tối màu, thời gian 1 tuần.
+ Axit HCl 3M: Lấy 126 mL HCl (37%) pha thành 500 mL bằng nước cất. + Dung dịch NaOH 1%: hòa tan 10 g NaOH trong 1000 mL nước cất; + Dung dịch NaBH4 3% trong NaOH 1%: hòa tan 30 g NaBH4 trong 1000 mL dung dịch NaOH 1%;
- Hóa chất chuẩn
+ Dung dịch chuẩn As 100 µg/L: lấy 1 mL dung dịch chuẩn As 10 mg/L, vào bình định mức 100 mL, thêm 20 mL dung dịch hỗn hợp KI 5% và axit
Ascorbic 5%. Đun nóng bằng bếp cách thủy ở 50 0C trong 15 phút, để nguội và định mức 100 mL bằng dung dịch HCl 3M.
+ Dung dịch chuẩn Sb 100 µg/L: lấy 1 mL dung dịch chuẩn As 10 mg/L vào bình định mức 100 mL, thêm và định mức 100 mL bằng dung dịch HCl 3M.
c. Thiết bị và dụng cụ
- Thiết bị
+ Cân phân tích 4 số lẻ. + Lò nung.
+ Hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử với các kỹ thuật đo hóa hơi và các phụ kiện.
Hình 2.5. Máy AAS sử dụng để xác định hàm lượng kim loại
- Dụng cụ + Pipet thủy tinh 1, 2, 5, 10 mL. + Bình định mức thủy tinh 10, 25, 50, 100, 1000 mL. + Chén nung. d. Cách tiến hành - Cân 5 g mẫu (chính xác đến 0,001 g), (M), thấm ướt mẫu bằng 5 mL Mg(NO3)2 7,5%, sấy khô, đốt trên bếp điện đến khi than hóa, đặt vào lò nung
nâng nhiệt từ từ đến 450 0C (tốc độ nâng nhiệt 500C/h) đến khi tro hóa hoàn toàn.
- Hòa tan tro và định mức 25 mL (Vdm) bằng HCl 3M. Dung dịch này
được dùng đểđo trên máy AAS - kỹ thuật đo hoá hơi.
đ. Xây dựng đường chuẩn, đo mẫu
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn As (Sb)
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn As (Sb) các điểm chuẩn có hàm lượng 20, 40, 60, 80, 100 ng: Hút 1mL dung dịch HCl 1:1 vào từng bình phản ứng, thêm lần lượt 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mL dung dịch chuẩn As (Sb) 100 mg/L.
- Xây dựng đường chuẩn
+ As: Thêm 0,5 mL dung dịch hỗn hợp (KI + ascorbic acid) 5% vào các bình phản ứng chứa các điểm chuẩn, để yên 15 phút, gắn vào bộ hóa hơi trên thiết bị và tiến hành đo.
+ Sb: Đo lần lượt các điểm chuẩn đã được chuẩn bị trong ống phản ứng, trên thiết bị.
+ Từ dữ liệu giá trị mật độ quang và hàm lượng các điểm chuẩn, phần mềm thiết bị sẽ dựng được đường chuẩn.
- Đo mẫu
+ As: Lấy Vh mL dung dịch mẫu (đã được xử lý tại Mục d) cho vào ống phản ứng, thêm 0,5 mL dung dịch hỗn hợp (KI + ascorbic acid) 5%, để yên 15 phút và tiến hành đo trên thiết bị.
+ Sb: Lấy Vh mL dung dịch mẫu (đã được xử lý tại Mục d) cho vào ống phản ứng, tiến hành đo trên thiết bị.
+ Từ giá trị mật độ quang thu được từ mẫu thử, phần mềm thiết bị sẽ tính
được hàm lượng As trong Vh mL mẫu đem đo là Cm (ng).
e. Tính kết quả
M V 1000 V C X h dm m ´ ´ ´ = Trong đó:
ØCm: hàm lượng của As (Sb) có trong mẫu đo được trên máy (ng);
ØVdm: thể tích định mức của mẫu (mL);
ØVh: thể tích mẫu lấy đểđo trên thiết bị (mL);
ØM: Khối lượng mẫu lấy để thử nghiệm (g).
Phương pháp này sử dụng để xác định hàm lượng kim loại As, Sb trong bột TQM.
2.4.4. Phương pháp xác định hàm lượng kim loại Hg [14]
a. Nguyên tắc
Mẫu được vô cơ hoá bằng lò vi sóng, sau đó đo trên máy AAS - kỹ thuật hoá hơi lạnh.
b. Hóa chất, hóa chất chuẩn
- Hóa chất
+ Nước cất sử dụng để thử nghiệm là nước cất hai lần hoặc nước cất có
độ tinh khiết tương đương.
+ Axit HNO3 (65%), của hãng Merck hoặc tương đương.
+ Dung dịch HNO3 16%: pha loãng 23 mL HNO3 đậm đặc thành 100 mL với nước cất trong bình định mức 100 mL;
+ H2O2 (30%), của hãng Merck hoặc tương đương.
+ Axit HNO3 0,1M: Lấy 7 mL HNO3 (65%) pha thành 1 lít bằng nước cất. + Dung dịch NaOH 1%: hòa tan 10 g NaOH trong 1000 mL nước cất; + Dung dịch NaBH4 3% trong NaOH 1%: hòa tan 30 g NaBH4 trong 1000 mL dung dịch NaOH 1%;
Dung dung dịch chuẩn Hg sử dụng để dựng đường chuẩn có nồng độ
100 mg/L, được pha trong HNO3 0,1M.
c. Thiết bị và dụng cụ
- Thiết bị
+ Cân phân tích 4 số lẻ. + Lò phá mẫu bằng vi sóng. + Tủ hút khí độc.
+ Hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử với các kỹ thuật đo hóa hơi và các phụ kiện.
- Dụng cụ
+ Pipet thủy tinh 1, 2, 5, 10 mL.
+ Bình định mức thủy tinh 10, 25, 50, 100, 1000 mL.
d. Cách tiến hành
- Cân khoảng 0,5 g (M) mẫu vào ống phá vô cơ hóa mẫu.
- Thêm vào ống mẫu 5 mL axít HNO3 đậm đặc, 2 mL H2O2 30%, lắc đều mẫu.
- Lắp ống mẫu vào roto lò vi sóng (vị trí các ống mẫu phải đối xứng, đưa lỗ thoát hơi ra ngoài, miếng đệm an toàn và nắp phải khô ráo).
- Khởi động cho vi sóng hoạt động theo chương trình cài đặt sẵn.
- Khi kết thúc chương trình phá vô cơ hóa mẫu, phải làm nguội trước khi mởống phá vô cơ hóa mẫu.
- Chuyển mẫu trong ống sau khi phá xong vào bình định mức 25 mL (Vdm), định mức bằng dung dịch HNO3 0,1M. Lắc đều, lọc nếu có cặn lơ lửng. Dung dịch này được dùng đểđo trên máy AAS - kỹ thuật hóa hơi lạnh.
đ. Xây dựng đường chuẩn, đo mẫu
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn
60, 80, 100 ng: Hút 1 mL dung dịch HNO3 15% vào từng bình phản ứng, thêm lần lượt 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mL dung dịch chuẩn Hg 100 mg/L.
- Xây dựng đường chuẩn
+ Đo lần lượt các điểm chuẩn đã được chuẩn bị trong ống phản ứng, trên thiết bị.
+ Từ dữ liệu giá trị mật độ quang và hàm lượng các điểm chuẩn, phần mềm thiết bị sẽ dựng được đường chuẩn.
- Đo mẫu
+ Lấy Vh mL dung dịch mẫu (đã được xử lý tại Mục d) cho vào ống phản
ứng, thêm 1 mL dung dịch HNO3 15%, gắn vào bộ hóa hơi trên thiết bị và tiến hành đo.
+ Từ giá trị mật độ quang thu được từ mẫu thử, phần mềm thiết bị sẽ tính
được hàm lượng Hg trong Vh mL mẫu đem đo là Cm (ng).
e. Tính kết quả
Hàm lượng của Hg có trong mẫu X (mg/kg) được tính theo công thức: M V 1000 V C X h dm m ´ ´ ´ = Trong đó:
ØCm: hàm lượng của Hg có trong mẫu đo được trên máy (ng);
ØVdm: thể tích định mức của mẫu (mL);
ØVh: thể tích mẫu lấy đểđo trên thiết bị (mL);
ØM: Khối lượng mẫu lấy để thử nghiệm (g).
Phương pháp này sử dụng để xác định hàm lượng kim loại Hg trong bột TQM.
2.4.5. Phương pháp xác định hàm lượng kim loại Cu, Zn, Pb, Cd [18]
a. Nguyên tắc
Mẫu được vô cơ hoá bằng phương pháp khô, sau đó đo bằng AAS kỹ
b. Hóa chất, hóa chất chuẩn
- Hóa chất
+ Nước cất sử dụng để thử nghiệm là nước cất hai lần hoặc nước cất có
độ tinh khiết tương đương.
+ Dung dịch HCl 1:1 (V:V) (tương đương dung dịch HCl 6M). + HNO3đậm đặc (65%, Merck).
+ Dung dịch HNO3 0,1M: lấy 7,0 mL HNO3 đậm đặc pha loãng đến 1 lít bằng nước cất.
+ Dung dịch HCl 1:1 (V:V) (tương đương dung dịch HCl 6M). + H2O2 30% (Merck).
+ Dung dịch bổ chính nền NH4H2PO4 10 g/L: hòa tan 1,0 g NH4H2PO4 trong 100 mL nước cất.
- Hóa chất chuẩn
+ Các dung dung dịch chuẩn Cu, Zn sử dụng để dựng đường chuẩn có nồng độ: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/L, được pha trong HNO3 0,1N.
+ Dung dung dịch chuẩn Pb sử dụng để dựng đường chuẩn có nồng độ
100 mg/L, được pha trong HNO3 0,1N.
+ Dung dung dịch chuẩn Cd sử dụng để dựng đường chuẩn có nồng độ
10 mg/L, được pha trong HNO3 0,1N.
c. Thiết bị và dụng cụ
- Thiết bị
+ Cân phân tích 4 số lẻ. + Lò nung.
+ Hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử với các kỹ thuật đo ngọn lửa và lò graphite.
- Dụng cụ
+ Bình định mức thủy tinh 10, 25, 50, 100, 1000 mL. + Chén nung.
d. Cách tiến hành
- Cân khoảng 5 g (M) mẫu vào chén nung.
- Đặt chén mẫu vào lò nung ở nhiệt độ < 100 oC, nâng từ từ nhiệt độ đến 450 oC (tốc độ nâng nhiệt 50 0C/h), giữở nhiệt độ này trong khoảng từ 6 - 8 giờ.
- Lấy chén nung ra khỏi lò nung, làm nguội đến nhiệt độ phòng, nếu tro chưa trắng thì thêm vào mẫu 1 - 2 mL dung dịch HNO3 0,1M, đun trên bếp
điện đến khô, hết axit, đưa vào lò nung, tiếp tục nung đến tro trắng.
- Tẩm ướt mẫu bằng vài giọt nước cất, thêm 5 mL dung dịch HCl 1:1, cô cạn cho hết acid trên bếp điện, hoà tan cặn bằng 15 mL HNO3 0,1M, chuyển mẫu vào bình định mức 25 mL (Vdm), định mức đến vạch bằng dung dịch axit HNO3 0,1M. Dung dịch này dùng đểđo trên máy AAS.
đ. Xây dựng đường chuẩn, đo mẫu
Mẫu được tiến hành đo lần lượt từng kim loại trên máy AAS - Kỹ thuật