a. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm
Gốc tự do nitric oxide (•NO) đƣợc sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau. Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào nhƣ đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thƣờng đƣợc sản sinh với lƣợng lớn khi xuất hiện c c đ p ứng viêm [25].
Một phƣơng ph p đƣợc sử dụng để x c định gián tiếp •NO là đo màu c c thành phần sản phẩm của nó (nitrate và nitrite). Phản ứng này đòi hỏi rằng nitrate (NO3) đầu tiên đƣợc giảm thành nitrite (NO2), do t c động của nitrate reductase.
Nitrite đƣợc phát hiện và phân tích bằng cách hình thành một màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa NO2- với thuốc thử Griess.
Khi thêm axit sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó c c thuốc nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) đƣợc thêm vào để tạo thành màu hồng.
Phƣơng ph p MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phƣơng ph p so màu, đo độ suy giảm màu để đ nh gi khả năng sống sót của tế bào. Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan không hoà tan, màu tím đậm. Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót đƣợc suy ra từ lƣợng formazan tạo thành từ MTT. Lƣợng formazan tạo thành đƣợc hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm đƣợc suy ra từ việc đ nh gi khả năng sống sót của tế bào [24], [30].
b. Phương pháp đánh giá độc tế bào
*Nguyên lý
Phƣơng ph p MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phƣơng ph p so màu, đo độ giảm màu vàng của MTT. MTT tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể. Có thể dùng một số dung môi hữu cơ (isopropanol) để vừa phá huỷ màng tế bào và hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học của các dung dịch này ở 570nm.
*C uẩn bị các dòn tế bào
Dòng tế bào ung thƣ gan ngƣời Hep3B đƣợc cung cấp bởi GS. Jeong-Hyung Lee, trƣờng ĐHQG Kangwon, Hàn Quốc. Tế bào ung thƣ đƣợc nuôi cấy in vitro
theo phƣơng ph p Mosmann và cs [31]. Các dòng tế bào nuôi cấy ở 37oC trong môi trƣờng RPMI 1640 hoặc DMEM có bổ sung huyết thanh nhau phôi bò 10% (FBS), 100U/ml penicillin và 100mcg/ml streptomycin trong tủ nuôi cấy CO2 5% trong 48 giờ.
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU