Dung môi chiết tách: metanol, n-hexan, diclometan, etyl axetat.
Cây Bồ công anh đƣợc thu h i, rửa sạch, phơi và sấy khô, nghiền nhỏ thu đƣợc bột khô (theo sơ đồ Hình 2.3, Mục 2.3, Chƣơng 2). Lấy 3.0 kg bột khô đem ngâm chiết với 15.0 lít metanol ở nhiệt độ phòng. Sau 48 giờ, lấy túi lọc ra vắt lấy dịch chiết, lọc qua giấy lọc để loại bỏ các tạp chất. Sau đó đem cô quay chân không để loại bỏ dung môi, tiếp tục cho bay hơi bằng bếp cách thủy có điều chỉnh nhiệt độ thích hợp thu đƣợc cao tổng methanol.
*Các bước điều chế phần chiết:
Cao chiết đƣợc phân bố vào nƣớc cất vừa đủ (200 ml nƣớc cất) và tiến hành chiết lắc lần lƣợt với n-hexan, diclometan, etyl axetat.
Bước 1: Cho vào phễu chiết 200ml (cao + nƣớc )
Bước 2: Cho tiếp 20 ml dung môi n- hexan vào phễu chiết.
Bước 3: cân bằng áp suất và lắc. Để yên trên gi đỡ 1 thời gian cho phân lớp và tiến hành chiết để thu đƣợc dịch chiết n-hexan. Lắc cho đến khi n-hexan không còn màu. Tiến hành tƣơng tự với diclometan và etyl axetat, ta lần lƣợt thu đƣợc các dịch chiết n-hexan, dichlometan, etyl axetat.
Bước 4 C c dịch chiết n-hexan, diclometan, etyl axetat đƣợc đem đun bay hơi trên bếp c ch thủy ở nhiệt độ phù hợp với mỗi loại dung môi, thu đƣợc cao n- hexan (BCAH, 31g), cao etyl axetat (BCAE, 12g), cao diclometan (BCAD, 8g)
2.3.3. Phƣơng ph p x c định thành phần h a học
Thành phần hóa học của cây bồ công anh đƣợc x c định bằng phƣơng ph p sắc kí khí ghép khối phổ (GC–MS) từ c c dịch chiết n-hexan, diclometan, etyl axetat.
Trong đó, hệ GC có cột tách mao quản Elite 35MS, kích thƣớc: 30 m x 250 µm x 0.25 µm, khí mang He. Chƣơng trình nhiệt độ : từ 50°C giữ 4 phút, tăng 5°C/phút đến 150°C giữ 5 phút, tăng 10°C/phút đến 280°C giữ 10 phút, thời gian chạy 52 phút. Buồng tiêm mẫu trƣớc, khí mang He, kiểu chia dòng. Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 280oC, áp suất dòng khí mang 7.6522 psi, tỉ lệ chia dòng 10:1 [9], [14], [15], [17].
2.3.4. Phƣơng ph p t ch và tinh chế chất
Cao chiết BCAH đƣợc tách và tinh chế bằng phƣơng ph p sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các đơn hoặc hệ dung môi thích hợp. Sắc kí cột gồm sắc kí cột thƣờng và sắc kí cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silica gel. Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH–20 hoặc ngƣợc pha Rp–18. Trƣờng hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phƣơng ph p kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng nhƣ theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với đơn hoặc hệ dung môi thích hợp [7], [11].
2.3.5. Quy trình phân lập chất và x c định công thức cấu tạo
a. Quy trình phân lập
Quy trình phân lập chất tinh khiết để x c định cấu trúc đƣợc thể hiện theo Hình 2.4.
Bột khô cây bồ công anh (3.0 kg) sau khi thực hiện quy trình theo sơ đồ Hình 2.3 (Mục 2.3, Chƣơng 2) và ngâm chiết ( theo Mục 2.3.2) thu đƣợc 31g cao chiết (ký hiệu: BCAH).
Cao chiết BCAH đƣợc t ch thô thành 7 phân đoạn, F1-F7, bằng cột silica gel, rửa giải gradient n-hexan-etyl axetat (50:1, 25:1, 10:1, 5:1, 2,5:1, 1:1, 0:1, v/v). Phân đoạn F6 (300 mg) đƣợc tách tiếp bằng cột silica gel, rửa giải bằng hệ n- hexan-etyl axetat (2:1, v/v, 3,5 lít) thành 5 phân đoạn, F6A - F6E. Tinh chế phân đoạn F6D (150 mg) lần lƣợt bằng dung môi n-hexan và axeton thu đƣợc hợp chất
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình phân lập chất từ cao chiết BCAH
Phân tích GC- MS 1) Silica gel
2) Gradient hệ dung môi n-hexan- etyl axetat 50:1- 1:1 1) Ủ khoảng 2h ở 45°C 2) Làm lạnh 3) n- hexan, nƣớc Dự đo n cấu trúc BCAH1 (31g) F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 1) Silica gel
2) Gradient hệ dung môi n-hexan- etyl axetat 2:1
F6C F6B F6A F6D F6E 1) n-hexan 2) Axeton BCAH 1 (25mg) 1) Toluen 2) MeOH Hỗn hợp
Dẫn xuất metyl este (FAME)
1) Phân tích GC- MS 2) Đo phổ NMR
b. Quá trình metanol phân hợp chất BCAH1
Hợp chất BCAH1 (1mg) đƣợc hòa tan trong 0.2 ml toluen. Sau đó bổ sung
thêm lần lƣợt 1.5 ml MeOH, 0.3 ml HCl 8% (pha trong MeOH). Hỗn hợp đƣợc ủ
khoảng 2 giờ ở 45 oC. Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 1 ml n-hexan và 1
ml nƣớc để chiết lấy dẫn xuất metyl este (FAME) tạo thành [32]. Dẫn xuất metyl
este đƣợc phân tích bằng phƣơng ph p GC-MS.
* Phân tích GC-MS đối với FAME
Dẫn xuất FAME đƣợc phân tích trên máy Shimadzu QP2010 Plus [Cột
Equity@-5 (Supelco) (0.25 mm x 30 m) cùng với đầu dò khối phổ MS QP2010 Plus.
Chế độ ion hóa va đập điện tử (EI) đƣợc sử dụng với năng lƣợng 70 eV. Khí mang Helium tinh khiết 99.99999% với tốc độ dòng 1.2 ml/phút. Mẫu đƣợc bơm tự động với thể tích 1µL. Nhiệt độ buồng tiêm, giao diện MS, buồng ion hóa lần lƣợt là 220,
280 và 230 oC. Điện thế đầu dò 0.82 kV, dải quét 40÷500 amu. Chƣơng trình nhiệt
độ lò GC: nhiệt độ đầu 80 o
C (giữ đẳng nhiệt trong 2 phút), tăng 10 oC/phút đến
180oC (giữ đẳng nhiệt trong 2 phút), tăng 2 oC/phút đến 220 oC (giữ đẳng nhiệt
trong 5 phút), tăng 5 oC/phút đến 240 o
C (giữ đẳng nhiệt trong 5 phút). Việc nhận dạng các hợp chất đƣợc thực hiện bằng cách so sánh dữ liệu phổ EI-MS của chúng với giá trị tƣơng ứng đã đƣợc liệt kê trong c c thƣ viện NIST 11 và WILEY 7. Hàm lƣợng của FAME đƣợc tính toán thông qua diện tích của píc tƣơng ứng trên sắc ký đồ.
2.3.6. Phƣơng ph p đ nh gi hoạt tính sinh học
a. Chuẩn bị m u
Mẫu c c hợp chất này đƣợc pha thành dung dịch gốc với nồng 100 mg/ml (đối với cặn chiết) hoặc 100 mM (đối với chất sạch) trong DMSO, sau đó pha loãng ở c c nồng độ kh c nhau.
b. Phương pháp tiến hành đánh giá hoạt tính kháng viêm
Tế bào RAW264.7 đƣợc nuôi cấy 48 giờ trong môi trƣờng DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphate. Sau đó chúng đƣợc nuôi
cấy trong giếng phiến 96 với mật độ 2.5 x 105 tế bào/giếng. Tế bào đƣợc kích thích với 2µL LPS (0.1mg/mL) trong 24 giờ với sự có mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ kh c nhau, đƣợc pha sẵn trong DMSO. Dịch nổi của tế bào phản ứng với thuốc thử Griess.NaNO2 ở các nồng độ kh c nhau đƣợc sử dụng để xây dựng đƣờng chuẩn. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm. Cardamonin đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng [30], [31].
Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đ nh gi c c hoạt tính invitro đƣợc bổ sung dung dịch MTT (0.5mg/ml pha trong PBS), ủ 4h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trƣờng trên bề mặt, kết tủa formazan đƣợc hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm.
* Tính kết quả
- Tính % ức chế NO
%UC =([Xtb](mẫu thử)-[Xtb]LPS)/([Xtb]Control-[Xtb]LPS)*100
Trong đó: [Xtb] : nồng độ NO trung bình, đƣợc tính toán dựa vào đƣờng chuẩn NaNO2
- Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trịCS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, Giá trị CS (%) đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn σ đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: xi: gi trị OD tại giếng i; x : gi trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại
Nồng độ ức chế 50%, IC50 đƣợc xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm. Giá trị IC50 đƣợc x c định theo phƣơng ph p hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 5.0.
c. Phương pháp tiến hành đánh giá độc tế bào
Tế bào đƣợc nuôi cấy 48 giờ trong môi trƣờng RPMI 1640 hoặc DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 units/mL) và streptomycin sulphate (100µg/mL). Sau đó chúng đƣợc nuôi cấy trong giếng phiến 96 với thể tích là 200 µl, mật độ 2-5 x 105 tế bào/giếng (tuỳ từng loại tế bào). Sau 24 giờ, chúng đƣợc thử với hợp chất pha sẵn ở các nồng độ khác nhau trong DMSO. Sau 72h, cho phản ứng với 0.5 mg/mL µl MTT, ủ 4h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trƣờng trên bề mặt, kết tủa formazan đƣợc hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570nm. Camptothecin đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng.
*Tính kết quả
Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì đƣợc đ nh gi là có hoạt tính.
Giá trị CS (%) đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn σ đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: xi: gi trị OD tại giếng i; x : gi trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50% ± σ) sẽ đƣợc chọn ra cho thử nghiệm bƣớc tiếp theo hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ 3.1.1. Độ ẩm 3.1.1. Độ ẩm
Số lƣợng mẫu đƣợc lấy để x c định độ ẩm là 3 mẫu. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 3 mẫu. Kết quả x c định độ ẩm của mẫu bột cây bồ công anh khô đƣợc trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác địn độ ẩm của mẫu cây bồ công anh khô
STT m0 (g) m1 (g) m2 (g) W(%) Wtb(%) 1 38.184 3.002 40.976 6.995 2 38.054 3.013 40.850 7.202 7.197 3 37.951 3.006 40.734 7.395 Trong đó m0: khối lƣợng cốc (g)
m1: khối lƣợng mẫu ban đầu (g)
m2: khối lƣợng cốc và mẫu sau khi sấy (g) W: độ ẩm của mỗi mẫu (%)
Nhận xét:
Độ ẩm trung bình của cây bồ công anh khô là 7.197% , đây là độ ẩm tƣơng đối an toàn theo theo tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV ( độ ẩm < 12%) [6]. Do đó có thể giữ đƣợc chất lƣợng tốt của nguyên liệu trong quá trình bảo quản, tránh sự xâm nhập của vi sinh vật và nấm mốc.
3.1.2. Hàm lƣợng tro
Bằng phƣơng ph p trọng lƣợng, hàm lƣợng tro của nguyên liệu đƣợc xác định và tổng hợp ở Bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả xác địn àm lượng tro trong mẫu cây bồ công anh khô STT m0 (g) m1 (g) m3 (g) % tro % trotb 1 38.184 3.002 38.330 4.863 2 38.054 3.013 38.203 4.945 4.955 3 37.951 3.006 38.103 5.057 Trong đó m0 : khối lƣợng cốc (g)
m1: khối lƣợng mẫu ban đầu (g)
m3: khối lƣợng cốc và mẫu sau khi nung (g)
Nhận xét:
Hàm lƣợng tro trung bình trong mẫu cây bồ công anh khô là 4.955%. Hàm lƣợng tro trung bình rất thấp, thấp hơn so với hàm lƣợng tro toàn phần của một số dƣợc liệu đƣợc quy định Dƣợc điển Việt Nam IV ( hàm lƣợng tro < 9%) [6].
3.1.3. Hàm lƣợng kim loại
Hàm lƣợng của 1 số kim loại nặng trong mẫu cây bồ công anh đƣợc x c định bằng phƣơng ph p đo AAS. Kết quả đƣợc tổng hợp ở Bảng 3.3
Bảng 3.3. Kết quả xác địn àm lượng một số kim loại nặng trong cây bồ công anh
Kim loại Hàm lƣợng (mg/kg) TCVN (mg/kg) Cu 11.120 30.000 Cd 0.018 0.200 Pb 0.217 0.300 Hg 0.055 1.000 As 0.256 1.000 Nhận xét:
định của bộ y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 th ng 4 năm 1992) về hàm lƣợng của kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô và căn cứ vào quyết định của thông tƣ ban hành các quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm hóa học trong thực phẩm năm 2011, cho thấy hàm lƣợng một số kim loại nặng trong cây bồ công anh đƣợc trình bày ở bảng trên là hàm lƣợng cho phép sử dụng, an toàn, không ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời, nên bồ công anh có thể dùng làm dƣợc phẩm chữa bệnh.
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT CÂY BỒ CÔNG ANH BẰNG CÁC DUNG MÔI CHIẾT CÂY BỒ CÔNG ANH BẰNG CÁC DUNG MÔI
3.2.1. Kết quả x c định thành phần h a học trong dịch chiết bằng dung môi n-hexan
Dịch chiết thu đƣợc khi chiết lắc cao tổng metanol của bột cây bồ công anh bằng dung môi n-hexan có màu xanh thẫm đƣợc bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng, lọc bỏ cặn bẩn và gửi đi đo GC-MS. Dịch chiết n-hexan từ cây bồ công anh đƣợc x c định thành phần hóa học bằng phƣơng ph p GC-MS, sắc kí đồ đƣợc thể hiện ở Hình 3.1 và kết quả định danh thành phần hóa học đƣợc tổng hợp ở Bảng 3.4.
Bản 3.4. Kết quả địn dan t àn p ần óa ọc và côn t ức cấu tạo tươn ứn tron dịc c ết n-hexan từ cây bồ côn an
STT Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lƣu
Công thức cấu tạo
1 2(5H)- Furanone 0.86 5.266 O O 2 2,5- Furandicarbonxaldehyde 2.18 7.871 O O H H O 3 Phenol, 2-methoxy- 2.74 8.089 OCH3 OH 4 4H- Pyran-4-one,2,3- dihydro-3,5-dihydroxy- 6-methyl- 8.38 9.043 O O OH O H Me 5 Coumaran 4.76 10.159 O 6 5- Hydroxymethylfurfural 24.57 10.480 O O H O H
STT Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lƣu
Công thức cấu tạo
7 Ethanone, 1-(2-hydroxy- 5- methylphenyl)- 11.50 11.632 O H O 8 Phenol, 2,6- dimethoxy- 7.05 12.144 O CH3 O C H3 OH 9 (3-Nitrophenyl)
methanol, n-propyl ether 19.56 13.487 O
N+ - O O 10 Octadecanoic acid 2.22 21.557 O O H 11 Isoshyobunone 2.61 21.837 O 12 Nookatone 5.53 22.223 O
STT Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lƣu
Công thức cấu tạo
13 Aristolene epoxide 1.18 22.484 O 14 Methyl Camphorsulfonates 2.50 23.980 O S O O O 15 Dehydroxy- isocalamendiol 4.36 24.891 OH Nhận xét:
Từ kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy phƣơng pháp GC-MS đã định danh đƣợc 15 cấu tử trong dịch chiết n-hexan từ cây bồ công anh. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan chủ yếu là những cấu tử phân cực bao gồm c c dẫn xuất phenol, ete thơm và c c cấu tử đều có hàm lƣợng kh cao.
Các cấu tử có hàm lƣợng cao nhƣ: 5-Hydroxymethylfurfural (24.57%), (3-Nitrophenyl) methanol, n-propyl ether (19.56%), Ethanone, 1-(2-hydroxy- 5- methylphenyl)- (11,5%), 4H- Pyran-4-one,2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl- (8.38%), Phenol, 2,6- dimethoxy- (7.05%), còn lại các cấu tử có hàm lƣợng thấp nhƣ: 2(5H)- Furanone (0.86%), Aristolene epoxide (1.18%), 2,5-
Furandicarbonxaldehyde (2.18%), Octadecanoic acid (2.22%), Methyl Camphorsulfonates (2.5%), Isoshyobunone (2.61%), Phenol, 2-methoxy- (2.74%), Dehydroxy- isocalamendiol (4.36%), Coumaran (4.76%), Nootkatone (5.53%).
Trong dịch chiết n-hexan từ cây bồ công anh có các chất có chứa hoạt tính sinh học rất cao, có ý nghĩa rất lớn trong thực tiễn. 5-Hydroxymethylfurfural (5 HMF) đã đƣợc xem xét để điều trị bệnh hồng cầu hình liềm, HMF còn đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm dƣới hình thức là chất phụ gia, chất tạo hƣơng liệu [40]. Octadecanoic acid (Acid stearic) là một axít béo no, chất này hiện diện trong nhiều dầu mỡ động vật và thực vật nhƣng phổ biến hơn trong mỡ động vật hơn là trong dầu thực vật; trong các nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng, acid stearic đƣợc tìm thấy có liên quan đến giảm cholesterol LDL so với các axit béo bão hòa khác [42]. Ngoài ra, axit stearic đƣợc sử dụng chủ yếu trong sản xuất chất tẩy rửa, xà phòng, mỹ phẩm nhƣ dầu gội và sản phẩm cạo râu kem; este của axit stearic với ethylene glycol , glycol stearate và glycol distearat , đƣợc sử dụng để tạo ra một hiệu ứng ngọc trai trong dầu gội, xà phòng và các sản phẩm mỹ phẩm khác; axit stearic đƣợc sử dụng cùng với c c loại đƣờng đơn giản hoặc xi-rô ngô nhƣ một chất làm cứng trong kẹo; axit stearic đƣợc sử dụng để sản xuất bổ sung chất trong chế độ ăn uống.
3.2.2. Kết quả x c định thành phần h a học trong dịch chiết bằng dung môi diclometan
Dịch chiết thu đƣợc khi chiết lắc cao tổng metanol của bột cây bồ công anh bằng dung môi diclometan có màu xanh thẫm đƣợc bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng, lọc bỏ cặn bẩn và gửi đi đo GC-MS. Dịch chiết diclometan từ cây bồ công anh đƣợc x c định thành phần hóa học bằng phƣơng ph p GC-MS, sắc kí đồ đƣợc thể hiện ở Hình 3.2 và kết quả định danh thành phần hóa học đƣợc tổng hợp ở Bảng 3.5.
Hình 3.2. GC- S của dịc c ết diclometan từ cây bồ côn an
Bản 3.5. Kết quả địn dan t àn p ần óa ọc và côn t ức cấu tạo tươn