Do cấu tạo hóa học của cây cỏ hoặc do sinh khối (biomass) thường là những chất đại phân tử (polymer, thí dụ như cellulose có trong cây cỏ, nấm mốc, thành tế bào vi sinh vật) tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ, vì thế việc khảo sát hợp chất thiên nhiên nghĩa là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ.
Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu ( lyophilic) có mức độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên cũng có khi nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái nước (hydrophilic). Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng dung môi vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các hợp chất tự nhiên)
Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này còn tùy thuộc vào đặc tính của chất
biến dưỡng thứ cấp có trong cây mà ta muốn tách cô lập. Như chúng ta đã biết những hợp chất tự nhiên có cấu trúc hóa học rất đa dạng, với tính chất phân cực khác biệt, nên không thể có một quy trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm, mà mỗi loại nhóm phải có một quy trình chiết tách đặc trưng. Vì vậy, trước khi tiến hành thực nghiệm ta phải thu thập đầy
đủ các tài liệu tham khảo có liên quan trực tiếp trên cây mới có thể chọn dung môi phù hợp.
Ngoài việc chọn dung môi phù hợp các hợp chất thiên nhiên muốn lấy ra khỏi cây cỏ còn phải sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, chiết soxhlet…. Sau khi chiết, phần bã cây hoặc sinh khối còn được lọc bỏ. Dung môi sau khi thu hồi còn được lọc cô quay chân không ở nhiệt độ
thấp 30-400C vì tiến hành ở nhiệt độ cao có thể làm hư hại một vài hợp chất kém bền nhiệt.
Cần chú ý quan sát quá trình cô quay có thể có tủa, lọc lấy tủa. Nếu tủa này tan trong nước thì đó là muối vô cơ (vì nếu sử dụng ethanol để chiết bột cây, ethanol hòa tan luôn cả các loại muối vô cơ có trong cây), nếu tủa không tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ thì đó là hợp chất hữu cơ, có thể tinh chế thu được hợp chất tinh khiết. Đây chỉ là một vài trường hợp đặc biệt khi hợp chất có hàm lượng cao trong cây. Trong quá trình thao tác thực nghiệm ta cần chú ý rằng khi một hợp chất cho kết tủa trong quá trình cô quay dung dịch thì trong dung dịch nước cái vẫn có chứa rất nhiều hợp chất đó.
Thu hồi dung môi thu được cao chiết thô, cao này có thể ở dạng khô, dạng dẻo sệt hoặc dạng dầu sệt tùy thuộc vào tính chất của các cấu tử có trong cao. Cao cần loại bỏ hết các dung môi còn sót lại để tránh các phản ứng phụ
khoảng thời gian, sau đó cân lại, nếu hai lần cân thấy khối lượng của lọ có trọng lượng xấp xĩ nhau là dung môi đã được đuổi hết ra khỏi cao.
Không nên tồn trữ hợp chất trong dung môi hữu cơ vì một vài hợp chất có thể có sự thay đổi không mong muốn cấu trúc hóa học.
Ví dụ: Dẫn xuất imin gossypol nếu được bảo quản ở dạng bột khô sẽ
luôn hiện diện ở dạng imin, nhưng nếu được để trong dung môi ở nhiệt độ
phòng, sau một vài giờ (hoặc vài ngày tùy theo từng loại dẫn xuất) sẽ có sự hổ
biến imin thành enamin.
1.3.2. Lựa chọn dung môi chiết tách
Chọn dung môi phải không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được các hợp chất cần khảo sát, phù hợp với phương pháp mà ta tiến hành phân tích (với phương pháp GC-MS ta phải chọn dung môi dễ bay hơi và ít phân cực…), phù hợp với điện kiện kinh tế và phải thông dụng, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, dung môi đó có thể loại bỏ một cách dễ dàng sau khi chiết tách.
Bảng 1.1. Các dung môi có độ phân cực tăng dần theo tham số
Snyder lực của dung môi
Tên dung môi E0 (Al2O3) Nhiệt độ sôi (0C) Độ nhớt (mN.S.m-2) Bước sóng hấp thu UV (nm) Pentan 0 36 0.24 210 Cyclohexan 0.04 69 0.98 210 Carbon tetraclorur 0.18 77 0.97 265 Toluene 0.29 111 0.59 286
Dietyl eter 0.38 35 0.25 218 Chloroform 0.40 62 0.57 245 Diclorometan 0.42 40 0.44 235 Tetrahydrofuran 0.45 66 0.55 220 2-butanon 0.51 80 0.32 330 Aceton 0.56 56 0.32 330 1,5-dioxan 0.56 107 1.44 215 Etyl axetat 0.58 77 0.45 255 Dietylamin 0.63 115 0.33 275 Acetonitrile 0.65 82 0.37 190 2-Propanol 0.82 82 2.50 210 Etanol 0.88 78 1.2 210 Methanol 0.95 64 0.59 210 Nước 1.00 100 1.00 -
Bảng 1.2. Các dung môi có độ phân cực tăng dần tùy theo hằng số điện môi và độ nhớt
Tên dung môi
Chỉ số phân cực Chỉ số chiết xuất (200C) Nhiệt độ sôi (0C) Hằng số điện môi ε (ở 250 C) Độ nhớt (mN.S. m-2) Bước sóng hấp thu UV Độ tan trong nước (%w/w) Pentan 0.0 1.358 36 - 0.23 200 0.004 Hexan 0.0 1.375 69 1.90 0.33 200 0.001
Heptan 0.0 1.387 98 - 0.39 200 0.0003 Cyclohexan 0.2 1.426 81 2.0 1.00 200 0.01 Carbon tetraclorur 1.6 1.466 77 2.2 0.97 263 0.08 Toluene 2.4 1.496 111 2.38 0.59 285 0.51 Xylen 2.5 1.500 139 - 0.61 290 0.018 Benzene 2.7 1.501 80 2.3 0.65 280 0.18 Dietyl eter 2.8 1.353 35 4.34 0.32 220 6.89 Diclorometan 3.1 1.424 41 8.9 0.44 235 1.6 Isopropanol 3.9 1.377 82 18.3 2.30 210 100 Butanol 3.9 1.399 118 - 2.98 215 7.81 Tetrahydrofuran 4.0 1.407 65 7.58 0.55 215 100 Propanol 4.0 1.384 92 20.1 2.27 210 100 Butyl axetat 4.0 1.394 125 - 0.73 254 0.43 Chloroform 4.1 1.446 61 4.87 0.57 245 0.81 Etyl axetat 4.4 1.372 77 6.0 0.45 260 8.7 Metyl etylceton 4.7 1.379 80 - 0.45 329 24 Dioxan 4.8 1.422 101 2.2 1.54 215 100 Aceton 5.1 1.359 56 20.7 0.32 330 100 Methanol 5.1 1.329 65 33.6 0.6 205 100 Etanol 5.2 1.360 78 24.3 1.2 210 100 Acetonitrile 5.8 1.344 82 37.5 0.37 190 100 Acid axetic 6.2 1.372 118 6.2 1.26 230 100
Dimetylformami 6.4 1.431 155 - 0.92 368 100 Dimetylsulfoxid 7.2 1.478 189 4.7 2.00 268 100 Nước 9.0 1.333 100 78.5 1.0 200 100 Người ta thường sử dụng các dung môi không hòa tan trong nước như
các hydrocacbon (hexan, toluene), alcol (butanol), axeton (metyl etyl xeton), axetat (etyl, butyl), chloroform, clorur metylen. Các loại dung môi này tương
đối rẻ tiền, có bán sẵn, độ nhớt thấp, tỉ trọng tương đối khác so với nước. Có thể sắp xếp độ phân cục của dung môi dựa vào E0, tham số Snyder lực của dung môi như trình bày trong bảng 1.1. Tham số này dựa trên sự hấp thu của pha động là dung môi trên pha tĩnh là alumina.
Cũng có thể sắp xếp độ phân cực của dung môi theo hằng số điện môi,
độ nhớt… trình bày trong bảng 1.2.
Các số liệu trong bảng 1.1 và 1.2 cho thấy có sự chênh lệch trong thứ tự
sắp xếp độ phân cực của dung môi.
1.3.3. Một số điều cần chú ý khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất hợp chất
Các dung môi cần được chưng cất và tồn trữ trong các chai lọ bằng thủy tinh, do dung môi thường chứa các tạp chất bẩn mà thường gặp nhất là chất làm dẻo hóa. Các chất làm dẻo thường gặp là dialkyl phtalat, n-butyl acetyl citrate, tri-n-butyl phosphate… chúng lẫn vào dung môi do dung môi thường được chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo.
Methanol và chloroform thường chứa tạp chất là di(2-etylhexyl) phtalat và chất này thường dễ bị nhầm lẫn là hợp chất tự nhiên có chứa trong cây cỏ đang khảo sát, dù rằng hợp chất này có chứa một số hoạt tính sinh học. Sỡ dĩ
cô lập được hợp chất này là do trước đó đã sử dụng một lượng rất lớn dung môi methanol, chloroform trong quá trình ngâm chiết cây cỏ ban đầu. Sau đó,
dung dịch chiết này được cô đuổi dung môi khiến cho số lượng chất dẻo hiện diện một cách đáng kể trong cao chiết.
Chloroform, diclorometan có thể tạo phản ứng với vài loại alkaloid như
brucin, strychnine, ephedrine… để tạo thành alkaloid dạng muối thứ cấp và một vài hợp chất giả tạo khác. Tương tự, như các vết HCl có thể gây ra sự
phân hủy, sự khử nước, sự đồng phân hóa cho vài hợp chất hữu cơ.
Sử dụng methanol để chiết có thể cô lập được một số hợp chất giả tạo. khi chiết nóng cây Trechonaetes laciniata với dung môi methanol thay vì cô lập được hợp chất trechonolid A thì ta có thể cô lập được trechonolid B (vì trechonolid A đã bị metlyl hóa khi đun nóng trong methanol có sự hiện diện của acid).
Dietyl eter ít được sử dụng để chiết vì nhiệt độ sôi thấp dễ cháy, độc, có thể gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo thành peoxit dễ gây nổ. Peoxit này rất hoạt tính có thể oxi hóa các hợp chất mang liên kết đôi như
carotenoid. Loại bỏ peoxit này ra khỏi cao dietyl eter bằng cách lắc với FeSO4 rồi chung cất lại.
Axeton có thể tạo ra dẫn xuất acetonid nếu hợp chất chiết có chứa nhóm cis-1,2-diol hiện diện trong dung môi acid.
Chiết bằng dung môi được điều chỉnh thành môi trường acid hoặc môi trường kiềm có thể chiết được hợp chất đặc trưng ( trước đó phải nghiên cứu kĩ) các anthocyanin được chiết ra khỏi nguyên liệu cây tươi ban đầu bằng dung dịch methanol có chứa 1%(w/v) acid clohidric. Các alkaloid có thể được chiết bởi dung dịch acid hoặc kiềm.
Chiết bằng dung môi acid hoặc kiềm có thể thủy giải các hợp chất glycoside (môi trường acid cắt đứt glycoside tại nối acetal làm mất đi phần
Ví dụ: Hợp chất scopine trong cây Hyoscyamus albus biến thành hợp chất oscine do sự chuyển vị epoxid
Sau khi chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cô chân không ở nhiệt
độ 30-400C, chưng cất ở nhiệt độ cao hơn có thể làm hư hại các hợp chất kém bền với nhiệt.
1.4. CÁC KĨ THUẬT CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT RA KHỎI CÂY
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Các kĩ
thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng. Trong thực nghiệm, việc chiết rắn-lỏng được áp dụng nhiều hơn gồm: sựu ngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự trích với máy chiết soxhlet. Sự chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn gọi là nước sắc. Ngoài ra có phương pháp chiết dựa vào quá trình lôi kéo hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn.
Ä Nhận xét
Trong luận văn này, sau khi tham khảo ý kiến của các thầy cô hướng dẫn, các tài liệu, các công trình về cây Muồng hoàng yến đã được nghiên cứu trước đó em đi đến quyết định chọn các dung môi có độ phân cực tăng dần như : petroleum ether, chloroform, etyl axetat, methanol với chỉ số phân cực lần lượt là 0.0, 4.1, 4.4, 5.1 và kĩ thuật chiết được áp dụng là chiết soxhlet song song (mẫu thực vật được chiết soxhlet với các dung môi trên cùng một lúc) và chiết soxhlet lần lượt (mẫu thực vật được chiết soxhlet lần lượt qua các dung môi theo chiều tăng dần độ phân cực của dung môi).
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu 2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là quả Muồng hoàng yến được thu hái vào tháng 6/2014 tại Liên Chiểu-Đà Nẵng.
Hình 2.1. Cây Muồng hoàng yến Liên Chiểu-Đà Nẵng
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
a. Hóa chất
Các dung môi dùng để chiết tách và tinh chế gồm: petroleum ether (Trung Quốc), etyl axetat (Trung Quốc), chloroform (Trung Quốc) và Methanol (Trung Quốc) đã được tinh chế bằng cách chưng cất lại để loại bỏ
tạp chất. Ngoài ra còn sử dụng một số hóa chất khác.
b. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) của Trung tâm đo lường chất lượng II, thành phố Đà Nẵng.
Thiết bị đo sắc ký khí ghép phổ khối (GS–MS) Agilent 7890A/5975C của Trung tâm đo lường chất lượng II, thành phốĐà Nẵng.
Tủ sấy, lò nung, cân phân tích,máy quay cất chân không. Các dụng cụ thí nghiệm khác như: cốc thủy tinh, bình tam giác, bếp cách thuỷ, cốc sứ, pipet, bình định mức, bình hút ẩm, nhiệt kế, cối chày sứ, giấy lọc... tại phòng thí nghiệm khoa Hóa, trường Ðại học Bách Khoa-Ðà Nẵng.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp xác định các thông số hóa lý
a. Phương pháp trọng lượng
Độ ẩm của cơm quả Muồng hoàng yến khô, của nguyên liệu bột khô và hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp trọng lượng.
b. Phương pháp hóa lí
Hàm lượng một số kim loại nặng có trong mẫu nguyên liệu nghiên cứu
được xác định phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS).
Thành phần hóa học trong các dịch chiết petroleum ether, chloroform, EtOAc, MeOH được xác định bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS).
2.2.2. Phương pháp chiếtmẫu thực vật
Mẫu thực vật được chiết theo hai cách:
Ø Cách thứ nhất: Mẫu thực vật khô được chiết soxhlet song song với các loại dung môi có độ phân cực khác nhau tăng dần như petroleum ether, chloroform, EtOAc và MeOH. Với mỗi loại dung môi được chiết và khảo sát
để có được thời gian và tỉ lệ rắn lỏng phù hợp nhất. Các dịch chiết được cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao petroleum ether, cao chloroform, cao EtOAc, cao MeOH) [4, 8].
Ø Cách thứ hai: Mẫu thực vật khô được chiết soxhlet lần lượt qua từng loại dung môi có độ phân cực khác nhau tăng dần như petroleum ether, chloroform, EtOAc và MeOH. Thu dịch chiết của từng dung môi. Sau mỗi lần thay dung môi, mở túi giấy chứa mẫu thực vật chiết cho bay hơi hết dung môi cũ, sau đó cho tiếp dung môi mới vào. Các dịch chiết thu được cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao petroleum ether, cao chloroform, cao EtOAc, cao MeOH) [4, 5, 9].
Hình 2.2. Mô hình chiết soxhlet thực nghiệm
2.2.3. Phương pháp phân tích và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết các dịch chiết
@ Trong luận văn này chúng tôi phân tích và xác định thành phần hóa học các dịch chiết petroleum ether, chloroform, EtOAc và MeOH của cơm quả Muồng hoàng yến thu được khi tiến hành chiết soxhlet song song và lần lượt bằng phương pháp đo sắc kí khí ghép phổ khối (GC-MS).
Phương pháp GC-MS dựa trên cơ sở “nối ghép”máy sắc kí khí (GC) vớimáy khối phổ (MS). Các chất sau khi đi qua cột GC có thể bị ion hóa và có khả năng đầy đủ để phân tích bởi máy khối phổ MS. Kĩ thuật sắc kí cho phép tách các cấu tử của hỗn hợp, có được các chất “nguyên chất” để đưa vào máy khối phổ với khả năng nhận diện rất ưu việt, đặc biệt là những chất có đặc trưng lưu giữ giống nhau hoặc tương tự nhau nhưng có phổ khối khác nhau nhờ đó có thể nhận diện được chúng. Phương pháp này chỉ được giới hạn với chất có thể bốc hơi mà không bị phân huỷ hay là trong khi phân huỷ cho sản phẩm phân huỷ xác định dưới thể hơi.
2.3. CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.3.1. Sơđồ thực nghiệm 2.3.1. Sơđồ thực nghiệm
Chiết soxhlet lần lượt với các dung môi: ete dầu hỏa, CHCl3, EtOAc, MeOH
Xác định hàm lượng tro Xác định hàm lượng kim loại Sấy, nghiền bột Bột cơm quả cây Muồng hoàng yến sau khi đã xử lý Cơm quả cây Muồng hoàng yến
(Thu hái tại Đà Nẵng)
Khảo sát điều kiện tối ưu: thời gian, tỉ lệ
rắn/lỏng
Chiết soxhlet song song với các dung môi: ete dầu hỏa, CHCl3, EtOAc, MeOH
Các dịch chiết petroleum ether, CHCl3, EtOAc, MeOH
Các cao khô petroleum ether, CHCl3, EtOAc, MeOH Định danh bằng phương
pháp: GC-MS
2.3.2. Xử lí nguyên liệu
Nguyên liệu quả Muồng hoàng yến được thu hái vào tháng 6/2014 tại Liên Chiểu-Đà Nẵng. Sau khi hái, chọn những quả đã chín, già, hình trụ có màu đen sẫm, có đốt, dài 20-60cm hoặc hơn, đường kính quả 15-25mm, khô cứng (loại bỏ
những quả đã bị hư, sâu), rửa sạch và để khô tự nhiên.