Chiết soxhlet lần lượt với các dung môi: ete dầu hỏa, CHCl3, EtOAc, MeOH
Xác định hàm lượng tro Xác định hàm lượng kim loại Sấy, nghiền bột Bột cơm quả cây Muồng hoàng yến sau khi đã xử lý Cơm quả cây Muồng hoàng yến
(Thu hái tại Đà Nẵng)
Khảo sát điều kiện tối ưu: thời gian, tỉ lệ
rắn/lỏng
Chiết soxhlet song song với các dung môi: ete dầu hỏa, CHCl3, EtOAc, MeOH
Các dịch chiết petroleum ether, CHCl3, EtOAc, MeOH
Các cao khô petroleum ether, CHCl3, EtOAc, MeOH Định danh bằng phương
pháp: GC-MS
2.3.2. Xử lí nguyên liệu
Nguyên liệu quả Muồng hoàng yến được thu hái vào tháng 6/2014 tại Liên Chiểu-Đà Nẵng. Sau khi hái, chọn những quả đã chín, già, hình trụ có màu đen sẫm, có đốt, dài 20-60cm hoặc hơn, đường kính quả 15-25mm, khô cứng (loại bỏ
những quả đã bị hư, sâu), rửa sạch và để khô tự nhiên.
Sau đó bóc quả ra để thu lấy cơm quả. Cơm quả tạo thành từng lớp,màu đen nhánh, dẻo, có mùi hôi nồng khó chịu.
Lấymột phần đi khảo sát độ ẩm, phần còn lại đem đi phơi khô rồi đem xay nhỏ, bảo quản trong bình kín có chứa chất hút ẩm.
2.3.3. Xác định các thông số hóa lí của nguyên liệu
a. Xác định độ ẩm
Dụng cụ, thiết bị: Chén sứđểđựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích.
Tiến hành: Chén sứ có kí hiệu sẵn, các chén sứ được rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến khối lượng không đổi. Sấy xong để vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các chén sứ.
Ø Xác định độ ẩm của quả Muồng hoàng yến tươi: Lấy vào 3 chén sứ,mỗi chén khoảng 5 gam cơm quả Muồng hoàng yến tươi đã được xử lí ở trên (theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén sứ). Tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 900C, cứ sau 5 giờ lại lấy ra cân, cứ tiến hành như vậy đến khi khối lượng của mẫu và chén sứ giữa 2 lần cân không đổi (sai số 0,01 gam) là được. Ghi lại giá trị khối lượng đó. Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau khi cân. Từđó suy ra độẩm trung bình của 3 mẫu.
Ø Xác định độ ẩm tương đối của nguyên liệu bột: Cho vào 3 chén sứ, mỗi chén khoảng 5 gam nguyên liệu bột đã chuẩn bị ở trên. Các bước tiếp theo thực hiện tương tự nhưđối với xác định độẩm của cơm quả Muồng hoàng yến tươi.
Ø Cách tính độẩm: - Độẩm mỗi mẫu: 0 1 0 m -m % 100% m w = ´ (2.1) - Độẩm trung bình: 3 1 TB (%) (%) 3 w w =å (2.2) Trong đó, m0 (gam): Khối lượng quả Muồng hoàng yến
m1 (gam) : Khối lượng quả Muồng hoàng yến sau khi sấy w (%) : Độẩm của mỗi mẫu
wTB (%) : Độ ẩm trung bình
b. Xác định hàm lượng tro
Tro toàn phần: Là khối lượng cắn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một mẫu thử trong điều kiện nhất định.
Dụng cụ: Chén sứđựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
Tiến hành: Để xác định hàm lượng tro trong cơm quả Muồng hoàng yến, ta cân khoảng 10 gam cơm quả tươi, cho vào cốc sứ đã sấy khô và biết chính xác khối lượng. Cho cốc sứ có chứa mẫu vào lò nung và nung ở nhiệt độ 4400C (nếu nhiệt độ cao hơn thì một số các kim loại sẽ bị bay hơi). Sau thời gian tro hoá khoảng 12 giờ, ta thấy cơm quả Muồng hoàng yến bị tro hoá hoàn toàn. Lúc này tro ở dạng bột mịn, màu xám trắng. Dùng kẹp sắt dài lấy cốc ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và ghi giá trị khối lượng. Tiếp tục cho cốc vào lò nung, nung 30 phút, lấy ra thực hiện lại quá trình trên đến khi khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp nhau không đổi (sai số 0,01 gam) thì dừng lại. Hàm lượng tro trong cơm quả Muồng hoàng yến tươi
được tính theo công thức:
1 0 .100% m H m = (2.3) Trong đó
m0 (gam): Khối lượng mẫu cơm quả Muồng hoàng yến tươi trước khi tro hoá m1 (gam): Khối lượng tro
H (%) : Hàm lượng tro trong cơm quả Muồng hoàng yến
c. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng
Mẫu cơm quả Muồng hoàng yến sau khi tro hoá được vô cơ hóa về dạng muối vô cơ dễ tan, cho toàn bộ mẫu tro hóa hòa tan trong dung dịch dung dịch HNO3 10% và định mức đến 100ml. Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác
định hàm lượng một số kim loại nặng là Pb, Cu, Zn, As bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại phòng thí nghiệm trung tâm đo lường chất lượng II, Quận Sơn Trà, thành phốĐà Nẵng.
Công thức chuyển đổi từ hàm lượng mg/l sang hàm lượng mg/kg như sau: (m g/kg) (m g/l) 0 C C 100 m = (2.4)
Trong đó,m0 : Khối lượng mẫu cơm quả Muồng hoàng yến trước khi tro hóa
2.3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chất
a. Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi
Cân 10g mẫu cho vào túi giấy lọc tiến hành chiết soxhlet song song với các loại dung môi với độ phân cực tăng dần (petroleum ether, chloroform, EtOAc, MeOH) với 150ml dung môi cho mỗi lần chiết. Chiết kiệt (khoảng 3 ngày) ở
nhiệt độ sôi của từng dung môi. Quan sát kết quả sự hòa tan cơm quả Muồng hoàng yến trong các dung môi khác nhau.
Sau đó, đem lọc và cho bay hơi dung môi thu được cao chiết trong các dung môi khác nhau. Đem cân khối lượng cắn.
b. Khảo sát thời gian
Hiệu suất của quá trình chiết các hợp chất từ mẫu rắn bằng dung môi còn phụ thuộc vào thời gian, thông thường hiệu suất chiết tăng theo thời gian và đến một lúc thì dừng lại.
Cân một lượng khoảng 10 gam các mẫu cơm quả Muồng hoàng yến, sau đó cho một lượng dung môi xác định Vml như nhau của cùng một dung môi. Tiến hành chiết bằng phương pháp chiết soxhlet với nhiệt độ như nhau tùy thuộc vào từng dung môi trong khoảng thời gian khác nhau: 6, 8, 10, 12 giờ.
Cô đuổi dung môi của các dịch chiết thu được cao chiết ở các thời gian chiết khác nhau, đem cân. Chọn thời gian chiết thích hợp nhất.
c. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ R/L
Cho cùng một lượng cơm quả Muồng hoàng yến khoảng 10 gam , sau đó cho các thể tích khác nhau của từng loại dung môi vào (V1, V2, V3,…ml). Tiến hành chiết trong khoảng thời gian thích hợp nhất đã chọn.
Cô đuổi dung môi của các dịch chiết thu được cao chiết ở các tỉ lệ R/L khác nhau. Xác định tỉ lệ R/L thích hợp nhất.
2.3.5. Chiết tách và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết cơm quả Muồng hoàng yến cơm quả Muồng hoàng yến
ØCách thứ nhất: 10 gmẫu thực vật khô được chiết soxhlet song song với
các loại dung môi có độ phân cực khác nhau tăng dần như petroleum ether, chloroform, EtOAc và MeOH. Với mỗi loại dung môi được chiết và khảo sát theo kết quả thời gian và tỉ lệ rắn lỏng phù hợp nhất. Lấy ở mỗi dịch chiết khoảng 5ml để đem phân tích GC-MS xác định thành phần và hàm lượng các
tăng 70C/min tăng 40C/min
cấu tử có trong mỗi dịch chiết.
ØCách thứ hai: 10g mẫu thực vật khô được chiết soxhlet lần lượt qua từng
loại dung môi có độ phân cực khác nhau tăng dần như petroleum ether, chloroform, EtOAc và MeOH với 150ml mỗi loại cho mỗi lần chiết và thời gian chiết là 3 ngày cho từng dung môi. Thu dịch chiết của từng dung môi. Sau mỗi lần thay dung môi, mở túi giấy chứa mẫu thực vật chiết cho bay hơi hết dung môi cũ, sau đó cho tiếp dung môi mới vào.
Đo GC-MS xác định thành phần hoá học có trong mỗi dịch chiết với trình chạy như sau:
- Máy Agilent 7693.
- Cột: Agilent 5 DB-MS, length : 30m, ID(mm) :0.25; Flim (Mcm) : 0.25 - Inlet temp: 2800C, Flow: 1ml/phút
- Trình nhiệt:
500C (0') 1200C (0') 2000C(5') 3000C (10').
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘẨM, HÀM LƯỢNG TRO VÀ HÀM LƯỢNG KIM LOẠI KIM LOẠI
3.1.1. Độẩm
Bằng phương pháp trọng lượng, độ ẩm của cơm quả Muồng hoàng yến tươi và của nguyên liệu bột khô được xác định và tổng hợp ở bảng 3.1 và bảng 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của cơm quả Muồng hoàng yến tươi
STT m0 (g) m1 (g) ω (%) 1 5.079 1.523 70.02 2 5.012 1,510 69.88 3 5.024 1.487 70.40 Độẩm trung bình ω TB (%) 70.10 % Trong đó:
m0 (gam): Khối lượng cơm quả Muồng hoàng yến tươi
m1 (gam) : Khối lượng cơm quả Muồng hoàng yến sau khi sấy w (%): Độẩm của mỗi mẫu
Ä Nhận xét:
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm của nguyên liệu bột khô cơm quả Muồng hoàng yến
STT m0 (g) m1 (g) w (%) 1 5.012 4.009 20.01 2 5.004 4.023 19.72 3 5.031 4.003 20.13 Độẩm trung bình wTB (%) 19.95 % Trong đó:
m0 (gam): Khối lượng bột cơm quả Muồng hoàng yến
m1 (gam): Khối lượng bột cơm quả Muồng hoàng yến sau khi sấy w (%): Độẩm của mỗi mẫu
Ä Nhận xét:
Độ ẩm trung bình của cơm quả Muồng hoàng yến là 70.10 %. Độ ẩm trung bình của nguyên liệu bột là 19.95 %. Qua kết quả ta thấy độẩm trung bình của cơm quả tươi và của nguyên liệu bột chênh lệch nhau nhiều. Cơm quả chứa nhiều chất nhầy dễ hút nước nên độ ẩm của hạt tương đối cao. Vì vậy chúng ta cần phải phơi khô cơm quả tươi và bảo quản trong môi trường chân không (hoặc là bình hút ẩm) trước khi dùng tránh tạo điều kiện cho vi sinh vật và côn trùng gây hại phát triển làm hư mẫu. Độ ẩm thay đổi tùy thuộc vào điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng nơi cây sống, vòng đời sinh trưởng, mùa hái, thời gian thu hái.
3.1.2. Hàm lượng tro
Bằng phương pháp trọng lượng, hàm lượng tro của nguyên liệu được xác
định và tổng hợp ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng tro trong cơm quả Muồng hoàng yến
STT m0 (g) m1 (g) H(%) 1 10.921 10.035 0.886 2 10.922 10.088 0.834 3 10.932 10.059 0.873
Hàm lượng tro trung bình Htb(%) 0.864 %
Trong đó: m0: Khối lượngmẫu trước khi tro hoá m1: Khối lượngmẫu sau khi tro hoá
H (%) : Hàm lượng tro trong cơm quả Muồng hoàng yến
Ä Nhận xét:
Hàm lượng tro trung bình trong cơm quả Muồng hoàng yến là 0.864 %. Từ
bảng 3.3 cho thấy trong cơm quả Muồng hoàng yến chứa một lượng rất ít các chất vô cơ, trong đó có thể có mặt muối của một số kim loại nhưng hàm lượng kim loại có trong cơm quả Muồng hoàng yến là không đáng kể.
3.1.3. Hàm lượng kim loại
Hàm lượng một số kim loại trong cơm quả Muồng hoàng yến được xác
Bảng 3.4. Hàm lượng kim loại trong cơm quả Muồng hoàng yến TT Kim loại Phương pháp thử (AAS) Kết quả (mg/l) Kết quả (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) [1] 1 Pb AOAC 999.11 0.0094 0.094 2 2 Cu AOAC 999.11 0.2755 2.755 30 3 Zn AOAC 999.11 1.079 10.79 40 4 As AOAC 986.15 0.0018 0.018 1 5 Hg AOAC 971.21 <0.05 <0.05 1 @Nhận xét:
Căn cứ vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho vệ sinh thực phẩm (theo quyết định của bộ y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng 4 năm 1992) về hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô, chúng tôi nhận thấy hàm lượng kim loại nặng có trong cơm quả Muồng hoàng yến thấp hơn nhiều so với hàm lượng tối đa cho phép. Do vậy có thể sử dụng an toàn cơm quả Muồng hoàng yến làm dược liệu. Tuy nhiên do ảnh hưởng của các điều kiện sinh thái và thời tiết các mùa thì hàm lượng kim loại trong cơm quả Muồng hoàng yến ở các
địa phương theo từng thời gian lấy mẫu có thể khác nhau.
3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT DUNG MÔI
Cân 10g mẫu cho vào túi giấy gấp bằng giấy lọc tiến hành chiết soxhlet lần lượt với các loại dung môi với độ phân cực tăng dần (petroleum ether,
chloroform, EtOAc, MeOH ) với 200ml dung môi cho mỗi lần chiết.
Chiết trong 3 ngày ở nhiệt độ sôi của từng dung môi. Dịch chiết cơm quả
Muồng hoàng yến bằng các dung môi: petroleum ether, chloroform, EtOAc và MeOH được thể hiện trong hình 3.1.
(1) (2) (3) (4)
Hình 3.1. Dịch chiết cơm quả Muồng hoàng yến trong các dungmôi petroleum ether (1), chloroform (2), EtOAc (3) và MeOH (4)
Các dịch chiết thu được cómàu đậm dần theo độ phân cực tăng dần của dung môi: petroleum ether, chloroform, EtOAc vàmeOH. Xét về mặt cảm quan dịch chiết petroleum ether của cơm quả Muồng hoàng yến có màu vàng chanh, dịch chiết chloroform có màu cam, dịch chiết EtOAc có màu vàng đậm và dịch chiết MeOH có màu đen.
Cô đuổi dung môi của các dịch chiết thu được các cao chiết. Kết quả thu
Bảng 3.5. Phần trăm khối lượng cao chiết trong các dungmôi
Khối lượng cao chiết (gam) Phần trăm khối lượng cao chiết (%) DungmôimeOH 0.502g 5.02% Dungmôi EtOAc 0.212g 2.12% Dungmôi chloroform 0.106g 1.06% Dungmôi petroleum ether 0.098g 0.98%
@Nhận xét:
Từ hình 3.1 và bảng 3.5, cao chiết cơm quả Muồng hoàng yến trong các dung môi giảm dần theo thứ tự sau: MeOH, chloroform, EtOAc và petroleum ether theo đúng độ giảm dần tính phân cực của các dung môi. Điều này dự báo cơm quả Muồng hoàng yến chứa nhiều hợp chất phân cực. Vì vậy, chúng tôi sử
dụng 4 loại dung môi này tiến hành chiết tách bằng phương pháp chiết soxhlet song song và chiết soxhlet lần lượt.
3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN, TỈ LỆ R/L TRONG QUÁ TRÌNH CHIẾT TÁCH VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT TÁCH VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH
CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SONG SONG 3.3.1. Trong dung môi petroleum ether
a. Kết quả khảo sát thời gian, tỉ lệ R/L trong quá trình chiết tách:
Điều kiện tiến hành: Bột cơm quả Muồng hoàng yến: 10 gam, thể tích petroleum ether thay đổi lần lượt là: 100, 125, 150, 175, 200ml, thời gian chiết
soxhlet: 6, 8, 10,12 h. Cất loại dung môi thu được cao chiết. Các kết quả thu
được trình bày trên bảng 3.6
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết và thể tích petroleum ether đến khối lượng cao chiết
Thế tích
petroleum ether (ml) 100 125 150 175 200
Thời gian chiết (giờ)
Khối lượng cao chiết (gam)
0.032 0.047 0.068 0.063 0.075 6 0.036 0.058 0.069 0.072 0.083 8 0.042 0.064 0.086 0.087 0.088 10 0.042 0.068 0.083 0.088 0.089 12
@Nhận xét:
Qua bảng 3.6 ta thấy, khi thể tích dung môi tăng và thời gian khảo sát tăng thì khối lượng cao chiết cũng tăng dần và đạt khối lượng cao nhất ở thời gian chiết 10 giờ với tỉ lệ R/L là 10/150 là 0.086g; thời gian chiết trong 12 giờ thì khối lượng cao chiết có tăng nhưng không đáng kể. Điều này có thể giải thích là do khi tăng thời gian chiết các chất trong cơm quả Muồng Hoàng Yến không hòa tan thêm được. Vậy thời gian chiết tối ưu là 10 giờ và tỉ lệ R/L thích hợp là 10g mẫu cơm quả Muồng Hoàng Yến/ 150ml dung môi petroleum ether.
a. Thành phần hóa học trong dịch chiết petroleum ether:
Phổ GC-MS của dịch chiết petroleum ether cơm quả Muồng hoàng yến được thể hiện ở hình 3.2. Kết quả xác
định thành phần hóa học được tổng hợp ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Thành phần hóa học trong dịch chiết petroleum ether bằng phương pháp chiết song song
STT RT Area % Name Formula 1 5.110 0.68 Heptane,2,2,4,6,6- pentamethyl- (C12H26) 2 8.065 0.48 4H-pyran-4-one,2,3- dihydro-3,5- dihydroxy-6-methyl (C6H8O4) 3 11.014 0.28 Naphthalene, 1- methy- (C11H10) 4 18.181 0.70 Hexadecane (C16H34) 5 19.816 0.35 Ethyl citrate (C12H20O7)
6 27.352 6.86 n-hexadecanoic acid (C16H32O2)
7 43.440 14.54 Gamma- sitosterol (C29H50O)
@ Nhận xét:
Từ kết quảở bảng 3.7 cho thấy phương pháp GC-MS đã xác định được 7 cấu tử trong dịch chiết petroleum ether từ cơm quả Muồng hoàng yến bao gồm hidrocacbonmạch dài 12C÷16C, hợp chất thơm và phytosterol. Các cấu tử chính là: gamma-sitosterol chiếm hàm lượng cao nhất 14.54%. Chất có hàm lượng tương đối cao tiếp theo là n-hexadecanoic acid chiếm 8.86 %. 4H-pyran-4-