2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là quả Muồng hoàng yến được thu hái vào tháng 6/2014 tại Liên Chiểu-Đà Nẵng.
Hình 2.1. Cây Muồng hoàng yến Liên Chiểu-Đà Nẵng
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
a. Hóa chất
Các dung môi dùng để chiết tách và tinh chế gồm: petroleum ether (Trung Quốc), etyl axetat (Trung Quốc), chloroform (Trung Quốc) và Methanol (Trung Quốc) đã được tinh chế bằng cách chưng cất lại để loại bỏ
tạp chất. Ngoài ra còn sử dụng một số hóa chất khác.
b. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) của Trung tâm đo lường chất lượng II, thành phố Đà Nẵng.
Thiết bị đo sắc ký khí ghép phổ khối (GS–MS) Agilent 7890A/5975C của Trung tâm đo lường chất lượng II, thành phốĐà Nẵng.
Tủ sấy, lò nung, cân phân tích,máy quay cất chân không. Các dụng cụ thí nghiệm khác như: cốc thủy tinh, bình tam giác, bếp cách thuỷ, cốc sứ, pipet, bình định mức, bình hút ẩm, nhiệt kế, cối chày sứ, giấy lọc... tại phòng thí nghiệm khoa Hóa, trường Ðại học Bách Khoa-Ðà Nẵng.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp xác định các thông số hóa lý
a. Phương pháp trọng lượng
Độ ẩm của cơm quả Muồng hoàng yến khô, của nguyên liệu bột khô và hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp trọng lượng.
b. Phương pháp hóa lí
Hàm lượng một số kim loại nặng có trong mẫu nguyên liệu nghiên cứu
được xác định phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS).
Thành phần hóa học trong các dịch chiết petroleum ether, chloroform, EtOAc, MeOH được xác định bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS).
2.2.2. Phương pháp chiếtmẫu thực vật
Mẫu thực vật được chiết theo hai cách:
Ø Cách thứ nhất: Mẫu thực vật khô được chiết soxhlet song song với các loại dung môi có độ phân cực khác nhau tăng dần như petroleum ether, chloroform, EtOAc và MeOH. Với mỗi loại dung môi được chiết và khảo sát
để có được thời gian và tỉ lệ rắn lỏng phù hợp nhất. Các dịch chiết được cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao petroleum ether, cao chloroform, cao EtOAc, cao MeOH) [4, 8].
Ø Cách thứ hai: Mẫu thực vật khô được chiết soxhlet lần lượt qua từng loại dung môi có độ phân cực khác nhau tăng dần như petroleum ether, chloroform, EtOAc và MeOH. Thu dịch chiết của từng dung môi. Sau mỗi lần thay dung môi, mở túi giấy chứa mẫu thực vật chiết cho bay hơi hết dung môi cũ, sau đó cho tiếp dung môi mới vào. Các dịch chiết thu được cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao petroleum ether, cao chloroform, cao EtOAc, cao MeOH) [4, 5, 9].
Hình 2.2. Mô hình chiết soxhlet thực nghiệm
2.2.3. Phương pháp phân tích và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết các dịch chiết
@ Trong luận văn này chúng tôi phân tích và xác định thành phần hóa học các dịch chiết petroleum ether, chloroform, EtOAc và MeOH của cơm quả Muồng hoàng yến thu được khi tiến hành chiết soxhlet song song và lần lượt bằng phương pháp đo sắc kí khí ghép phổ khối (GC-MS).
Phương pháp GC-MS dựa trên cơ sở “nối ghép”máy sắc kí khí (GC) vớimáy khối phổ (MS). Các chất sau khi đi qua cột GC có thể bị ion hóa và có khả năng đầy đủ để phân tích bởi máy khối phổ MS. Kĩ thuật sắc kí cho phép tách các cấu tử của hỗn hợp, có được các chất “nguyên chất” để đưa vào máy khối phổ với khả năng nhận diện rất ưu việt, đặc biệt là những chất có đặc trưng lưu giữ giống nhau hoặc tương tự nhau nhưng có phổ khối khác nhau nhờ đó có thể nhận diện được chúng. Phương pháp này chỉ được giới hạn với chất có thể bốc hơi mà không bị phân huỷ hay là trong khi phân huỷ cho sản phẩm phân huỷ xác định dưới thể hơi.
2.3. CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.3.1. Sơđồ thực nghiệm 2.3.1. Sơđồ thực nghiệm
Chiết soxhlet lần lượt với các dung môi: ete dầu hỏa, CHCl3, EtOAc, MeOH
Xác định hàm lượng tro Xác định hàm lượng kim loại Sấy, nghiền bột Bột cơm quả cây Muồng hoàng yến sau khi đã xử lý Cơm quả cây Muồng hoàng yến
(Thu hái tại Đà Nẵng)
Khảo sát điều kiện tối ưu: thời gian, tỉ lệ
rắn/lỏng
Chiết soxhlet song song với các dung môi: ete dầu hỏa, CHCl3, EtOAc, MeOH
Các dịch chiết petroleum ether, CHCl3, EtOAc, MeOH
Các cao khô petroleum ether, CHCl3, EtOAc, MeOH Định danh bằng phương
pháp: GC-MS
2.3.2. Xử lí nguyên liệu
Nguyên liệu quả Muồng hoàng yến được thu hái vào tháng 6/2014 tại Liên Chiểu-Đà Nẵng. Sau khi hái, chọn những quả đã chín, già, hình trụ có màu đen sẫm, có đốt, dài 20-60cm hoặc hơn, đường kính quả 15-25mm, khô cứng (loại bỏ
những quả đã bị hư, sâu), rửa sạch và để khô tự nhiên.
Sau đó bóc quả ra để thu lấy cơm quả. Cơm quả tạo thành từng lớp,màu đen nhánh, dẻo, có mùi hôi nồng khó chịu.
Lấymột phần đi khảo sát độ ẩm, phần còn lại đem đi phơi khô rồi đem xay nhỏ, bảo quản trong bình kín có chứa chất hút ẩm.
2.3.3. Xác định các thông số hóa lí của nguyên liệu
a. Xác định độ ẩm
Dụng cụ, thiết bị: Chén sứđểđựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích.
Tiến hành: Chén sứ có kí hiệu sẵn, các chén sứ được rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến khối lượng không đổi. Sấy xong để vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các chén sứ.
Ø Xác định độ ẩm của quả Muồng hoàng yến tươi: Lấy vào 3 chén sứ,mỗi chén khoảng 5 gam cơm quả Muồng hoàng yến tươi đã được xử lí ở trên (theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén sứ). Tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 900C, cứ sau 5 giờ lại lấy ra cân, cứ tiến hành như vậy đến khi khối lượng của mẫu và chén sứ giữa 2 lần cân không đổi (sai số 0,01 gam) là được. Ghi lại giá trị khối lượng đó. Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau khi cân. Từđó suy ra độẩm trung bình của 3 mẫu.
Ø Xác định độ ẩm tương đối của nguyên liệu bột: Cho vào 3 chén sứ, mỗi chén khoảng 5 gam nguyên liệu bột đã chuẩn bị ở trên. Các bước tiếp theo thực hiện tương tự nhưđối với xác định độẩm của cơm quả Muồng hoàng yến tươi.
Ø Cách tính độẩm: - Độẩm mỗi mẫu: 0 1 0 m -m % 100% m w = ´ (2.1) - Độẩm trung bình: 3 1 TB (%) (%) 3 w w =å (2.2) Trong đó, m0 (gam): Khối lượng quả Muồng hoàng yến
m1 (gam) : Khối lượng quả Muồng hoàng yến sau khi sấy w (%) : Độẩm của mỗi mẫu
wTB (%) : Độ ẩm trung bình
b. Xác định hàm lượng tro
Tro toàn phần: Là khối lượng cắn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một mẫu thử trong điều kiện nhất định.
Dụng cụ: Chén sứđựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
Tiến hành: Để xác định hàm lượng tro trong cơm quả Muồng hoàng yến, ta cân khoảng 10 gam cơm quả tươi, cho vào cốc sứ đã sấy khô và biết chính xác khối lượng. Cho cốc sứ có chứa mẫu vào lò nung và nung ở nhiệt độ 4400C (nếu nhiệt độ cao hơn thì một số các kim loại sẽ bị bay hơi). Sau thời gian tro hoá khoảng 12 giờ, ta thấy cơm quả Muồng hoàng yến bị tro hoá hoàn toàn. Lúc này tro ở dạng bột mịn, màu xám trắng. Dùng kẹp sắt dài lấy cốc ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và ghi giá trị khối lượng. Tiếp tục cho cốc vào lò nung, nung 30 phút, lấy ra thực hiện lại quá trình trên đến khi khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp nhau không đổi (sai số 0,01 gam) thì dừng lại. Hàm lượng tro trong cơm quả Muồng hoàng yến tươi
được tính theo công thức:
1 0 .100% m H m = (2.3) Trong đó
m0 (gam): Khối lượng mẫu cơm quả Muồng hoàng yến tươi trước khi tro hoá m1 (gam): Khối lượng tro
H (%) : Hàm lượng tro trong cơm quả Muồng hoàng yến
c. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng
Mẫu cơm quả Muồng hoàng yến sau khi tro hoá được vô cơ hóa về dạng muối vô cơ dễ tan, cho toàn bộ mẫu tro hóa hòa tan trong dung dịch dung dịch HNO3 10% và định mức đến 100ml. Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác
định hàm lượng một số kim loại nặng là Pb, Cu, Zn, As bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại phòng thí nghiệm trung tâm đo lường chất lượng II, Quận Sơn Trà, thành phốĐà Nẵng.
Công thức chuyển đổi từ hàm lượng mg/l sang hàm lượng mg/kg như sau: (m g/kg) (m g/l) 0 C C 100 m = (2.4)
Trong đó,m0 : Khối lượng mẫu cơm quả Muồng hoàng yến trước khi tro hóa
2.3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chất
a. Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi
Cân 10g mẫu cho vào túi giấy lọc tiến hành chiết soxhlet song song với các loại dung môi với độ phân cực tăng dần (petroleum ether, chloroform, EtOAc, MeOH) với 150ml dung môi cho mỗi lần chiết. Chiết kiệt (khoảng 3 ngày) ở
nhiệt độ sôi của từng dung môi. Quan sát kết quả sự hòa tan cơm quả Muồng hoàng yến trong các dung môi khác nhau.
Sau đó, đem lọc và cho bay hơi dung môi thu được cao chiết trong các dung môi khác nhau. Đem cân khối lượng cắn.
b. Khảo sát thời gian
Hiệu suất của quá trình chiết các hợp chất từ mẫu rắn bằng dung môi còn phụ thuộc vào thời gian, thông thường hiệu suất chiết tăng theo thời gian và đến một lúc thì dừng lại.
Cân một lượng khoảng 10 gam các mẫu cơm quả Muồng hoàng yến, sau đó cho một lượng dung môi xác định Vml như nhau của cùng một dung môi. Tiến hành chiết bằng phương pháp chiết soxhlet với nhiệt độ như nhau tùy thuộc vào từng dung môi trong khoảng thời gian khác nhau: 6, 8, 10, 12 giờ.
Cô đuổi dung môi của các dịch chiết thu được cao chiết ở các thời gian chiết khác nhau, đem cân. Chọn thời gian chiết thích hợp nhất.
c. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ R/L
Cho cùng một lượng cơm quả Muồng hoàng yến khoảng 10 gam , sau đó cho các thể tích khác nhau của từng loại dung môi vào (V1, V2, V3,…ml). Tiến hành chiết trong khoảng thời gian thích hợp nhất đã chọn.
Cô đuổi dung môi của các dịch chiết thu được cao chiết ở các tỉ lệ R/L khác nhau. Xác định tỉ lệ R/L thích hợp nhất.
2.3.5. Chiết tách và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết cơm quả Muồng hoàng yến cơm quả Muồng hoàng yến
ØCách thứ nhất: 10 gmẫu thực vật khô được chiết soxhlet song song với
các loại dung môi có độ phân cực khác nhau tăng dần như petroleum ether, chloroform, EtOAc và MeOH. Với mỗi loại dung môi được chiết và khảo sát theo kết quả thời gian và tỉ lệ rắn lỏng phù hợp nhất. Lấy ở mỗi dịch chiết khoảng 5ml để đem phân tích GC-MS xác định thành phần và hàm lượng các
tăng 70C/min tăng 40C/min
cấu tử có trong mỗi dịch chiết.
ØCách thứ hai: 10g mẫu thực vật khô được chiết soxhlet lần lượt qua từng
loại dung môi có độ phân cực khác nhau tăng dần như petroleum ether, chloroform, EtOAc và MeOH với 150ml mỗi loại cho mỗi lần chiết và thời gian chiết là 3 ngày cho từng dung môi. Thu dịch chiết của từng dung môi. Sau mỗi lần thay dung môi, mở túi giấy chứa mẫu thực vật chiết cho bay hơi hết dung môi cũ, sau đó cho tiếp dung môi mới vào.
Đo GC-MS xác định thành phần hoá học có trong mỗi dịch chiết với trình chạy như sau:
- Máy Agilent 7693.
- Cột: Agilent 5 DB-MS, length : 30m, ID(mm) :0.25; Flim (Mcm) : 0.25 - Inlet temp: 2800C, Flow: 1ml/phút
- Trình nhiệt:
500C (0') 1200C (0') 2000C(5') 3000C (10').
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘẨM, HÀM LƯỢNG TRO VÀ HÀM LƯỢNG KIM LOẠI KIM LOẠI
3.1.1. Độẩm
Bằng phương pháp trọng lượng, độ ẩm của cơm quả Muồng hoàng yến tươi và của nguyên liệu bột khô được xác định và tổng hợp ở bảng 3.1 và bảng 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của cơm quả Muồng hoàng yến tươi
STT m0 (g) m1 (g) ω (%) 1 5.079 1.523 70.02 2 5.012 1,510 69.88 3 5.024 1.487 70.40 Độẩm trung bình ω TB (%) 70.10 % Trong đó:
m0 (gam): Khối lượng cơm quả Muồng hoàng yến tươi
m1 (gam) : Khối lượng cơm quả Muồng hoàng yến sau khi sấy w (%): Độẩm của mỗi mẫu
Ä Nhận xét:
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm của nguyên liệu bột khô cơm quả Muồng hoàng yến
STT m0 (g) m1 (g) w (%) 1 5.012 4.009 20.01 2 5.004 4.023 19.72 3 5.031 4.003 20.13 Độẩm trung bình wTB (%) 19.95 % Trong đó:
m0 (gam): Khối lượng bột cơm quả Muồng hoàng yến
m1 (gam): Khối lượng bột cơm quả Muồng hoàng yến sau khi sấy w (%): Độẩm của mỗi mẫu
Ä Nhận xét:
Độ ẩm trung bình của cơm quả Muồng hoàng yến là 70.10 %. Độ ẩm trung bình của nguyên liệu bột là 19.95 %. Qua kết quả ta thấy độẩm trung bình của cơm quả tươi và của nguyên liệu bột chênh lệch nhau nhiều. Cơm quả chứa nhiều chất nhầy dễ hút nước nên độ ẩm của hạt tương đối cao. Vì vậy chúng ta cần phải phơi khô cơm quả tươi và bảo quản trong môi trường chân không (hoặc là bình hút ẩm) trước khi dùng tránh tạo điều kiện cho vi sinh vật và côn trùng gây hại phát triển làm hư mẫu. Độ ẩm thay đổi tùy thuộc vào điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng nơi cây sống, vòng đời sinh trưởng, mùa hái, thời gian thu hái.
3.1.2. Hàm lượng tro
Bằng phương pháp trọng lượng, hàm lượng tro của nguyên liệu được xác
định và tổng hợp ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng tro trong cơm quả Muồng hoàng yến
STT m0 (g) m1 (g) H(%) 1 10.921 10.035 0.886 2 10.922 10.088 0.834 3 10.932 10.059 0.873
Hàm lượng tro trung bình Htb(%) 0.864 %
Trong đó: m0: Khối lượngmẫu trước khi tro hoá m1: Khối lượngmẫu sau khi tro hoá
H (%) : Hàm lượng tro trong cơm quả Muồng hoàng yến
Ä Nhận xét:
Hàm lượng tro trung bình trong cơm quả Muồng hoàng yến là 0.864 %. Từ
bảng 3.3 cho thấy trong cơm quả Muồng hoàng yến chứa một lượng rất ít các chất vô cơ, trong đó có thể có mặt muối của một số kim loại nhưng hàm lượng kim loại có trong cơm quả Muồng hoàng yến là không đáng kể.
3.1.3. Hàm lượng kim loại
Hàm lượng một số kim loại trong cơm quả Muồng hoàng yến được xác
Bảng 3.4. Hàm lượng kim loại trong cơm quả Muồng hoàng yến TT Kim loại Phương pháp thử (AAS) Kết quả (mg/l) Kết quả (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) [1] 1 Pb AOAC 999.11 0.0094 0.094 2 2 Cu AOAC 999.11 0.2755 2.755 30 3 Zn AOAC 999.11 1.079 10.79 40 4 As AOAC 986.15 0.0018 0.018 1 5 Hg AOAC 971.21 <0.05 <0.05 1 @Nhận xét:
Căn cứ vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho vệ sinh thực phẩm (theo quyết định của bộ y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng 4 năm 1992) về hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô, chúng tôi nhận thấy hàm lượng kim loại nặng có trong cơm quả Muồng hoàng yến thấp hơn nhiều so với hàm lượng tối đa cho phép. Do vậy có thể sử dụng an toàn cơm quả Muồng hoàng yến làm dược liệu. Tuy nhiên do ảnh hưởng của các điều kiện sinh thái và thời tiết các mùa thì hàm lượng kim loại trong cơm quả Muồng hoàng yến ở các
địa phương theo từng thời gian lấy mẫu có thể khác nhau.
3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT DUNG MÔI
Cân 10g mẫu cho vào túi giấy gấp bằng giấy lọc tiến hành chiết soxhlet lần lượt với các loại dung môi với độ phân cực tăng dần (petroleum ether,
chloroform, EtOAc, MeOH ) với 200ml dung môi cho mỗi lần chiết.
Chiết trong 3 ngày ở nhiệt độ sôi của từng dung môi. Dịch chiết cơm quả