6. Cấu trúc của luận văn
1.6.2. Đặc điểm và độc tố
E.coli hay còn gọi là vi khuẩn đại tràng, là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của người và động vật máu nóng. Chúng được phát hiện đầu tiên vào năm 1885 do Escherich phát hiện, thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae. Chúng là các trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình (2 - 3 µm) x 0,5 µm. Trong những điều kiện không thích hợp vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ. E.Coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng, có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 – 400
C, nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C. Trong điều kiện thích hợp E.Coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ khoảng 20 phút đến 30 phút.
Kể từ khi E.coli lần đầu tiên xác định được hơn một trăm năm trước đây nó đã được biết đến như là một phần của các vi khuẩn bình thường sống trong ruột già của nhiều động vật có vú, kể cả con người. Không chỉ không làm hại chúng ta, nó thực sự giúp chúng ta bằng cách sản xuất vitamin như vitamin K và vitamin B-phức tạp mà chúng ta không thể làm cho bản thân mình. Ruột của con người có hàng t vi khuẩn và chúng còn giúp chúng ta bằng cách sinh sôi ở đó và ngăn ngừa vi khuẩn nguy hiểm từ phát triển. Những động vật từ ngay sau khi sinh không có vi khuẩn E.coli trong ruột của chúng thì những sinh vật này rất ốm yếu và yêu cầu số lượng
lớn các vitamin để tồn tại. E.coli là nguyên nhân gây ra các bệnh, như tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật. Là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thường gặp trong bệnh viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. E.coli thường gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. Trên thực tế, sự tiêu thụ thực phẩm nhiễm phân ( đặc biệt phân gia súc) đều có thể dẫn đến việc nhiễm bệnh. Các thực phẩm được xác định là nguồn gây bệnh bao gồm thịt bò xay, thịt nai, xúc xích sấy khô, sữa chưa tiệt trùng, phomai, nước trái cây chưa tiệt trùng, cỏ linh lăng, mầm củ cải, rau và nước. [42]
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu
- Nguồn nguyên liệu: Vỏ cây keo lá tràm thu từ cây keo lá tràm ở thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam.
- Vỏ cây keo sau khi lấy về sẽ được bỏ đi những phần đen bên ngoài và một số phần hư hại do các tác nhân khách quan từ bên ngoài. Sau khi xử lí xong tiến hành đem phơi ngoài nắng trong vòng 1 ngày rồi sau đó phân chia các phần nhỏ nguyên liệu, tiến hành xay nguyên liệu ở nhiều kích cỡ khác nhau để sử dụng cho các khảo sát sau này.
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất
Khi tiến hành các khảo sát này chúng tôi mượn riêng của phòng thí nghiệm khu B2-Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng một số dụng cụ dùng riêng:
- 8 cốc thu tinh loại 80 mL và 2 cốc thu tinh 250 mL ( 2 cốc chỉ dùng cho việc hoà tan AgNO3 và Tanin rắn).
- 2 đũa thu tinh. - 1 con từ.
- Bình định mức: 2 cái, gồm 1 cái có V = 250 mL, 1 cái có V = 1000 mL. - Pipet ở các thể tích 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL.
- Các dụng cụ đựng nước cất 2 lần
Trước khi làm các khảo sát các dụng cụ được rửa kĩ bằng nước cất 2 lần và sấy khô bằng lò sấy.
Pha các dung dịch trong các khảo sát.
- sunfoindigocarmin; dung dịch H2SO4 98%; dung dịch FeCl3 5% ;
- Dung dịch AgNO3 1mM: cân chính xác 0,0425g AgNO3 sau đó hoà tan lượng cân được trong cốc bằng một thể tích xác định nước cất 2 lần rồi định mức trong bình định mức 250 mL.
- Dung dịch từ tanin rắn: cân chính xác 1,00g tanin rắn trên cân phân tích sau đó tiến hành hoà tan bằng máy khuấy từ có gia nhiệt trong khoảng thời gian 30 phút cho hoà tan hết lượng tanin rắn trong dung dịch, lọc lại dịch lọc rồi định mức trong bình định mức 1000mL. Cách pha tương tự với các dung dịch tanin có nồng độ 2g/1000 mL; 3g/1000 mL; 4g/1000 mL; 5g/1000 mL.
2.2. QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH TANIN TỪ VỎ CÂY KEO LÁ TRÀM
Quy trình chiết tách tanin từ vỏ cây keo lá tràm theo sơ đồ quy trình thực nghiệm theo Hình 2.1
2.2.1. Tiến hành khảo sát các thông số vật lí của nguyên liệu
a. ác định độ ẩm
+ Nguyên tắc: sấy nguyên liệu khô đến khối lượng không đổi. + Tiến hành:
-Sấy cốc cân sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 100 C đến trọng lượng không đổi (dùng cân phân tích để cân lại đến khi khối lượng không đổi với giá trị m0(g)),đưa vào cốc chính xác 2g bột vỏ keo lá tràm,đem cân trên cân phân tích và ghi nhận giá trị cốc lẫn bột có khối lượng m1(g).
- Đặt mẫu vừa cân vào tủ sấy ở nhiệt độ 100 C tiếp tục sấy khoảng 5 giờ liên tục. Sau lấy cốc ra để cốc giảm nhiệt độ đồng thời đưa vào bình hút ẩm khoảng 15 - 20 phút, rồi cân cốc này trên cân phân tích.
- Tiếp tục sấy cốc này trong tủ sấy khoảng 2 giờ đồng hồ, sau cân mẫu này, lần lượt thực hiện lại các bước này cho đến khi khối lượng cốc giữa các lần sấy là không đổi. Ghi nhận giá trị này là m2
- Công thức tính độ ẩm mẫu: W ( ) = 1 2 1 0 m - m . 100% (2.1) m - m Trong đó:
W( ): độ ẩm của mẫu tính theo %
m0: khối lượng cốc khi sấy đến khối lượng không đổi. m1:khối lượng cốc và mẫu khi chưa sấy.
m2:khối lượng cốc và mẫu khi sấy đến khối lượng không đổi.
b. ác định hàm lượng tro
+ Nguyên tắc:
Tro hoá bằng nhiệt, rồi xác định hàm lượng tro bằng phương pháp khối lượng.
+ Tiến hành:
- Làm sạch rồi sấy khô cốc ở nhiệt độ 1050C khoảng nữa tiếng sau đó nung lại bằng lò nung cũng ỏ nhiệt độ và thời gian trên,sau đó lấy ra làm nguội trong bình
hút ẩm,và cân cốc (quá trình nung cốc được làm lặp lại cho đến khi khối lượng cốc là không đổi).
- Đốt mẫu trên bếp điện để than hoá.
Tiếp tục nung mẫu trong lò nung đến khi thu được tro màu trắng ngà, làm nguội trong bình hút ẩm và nung lặp đi lặp lại cho đến khi khối lượng không đổi.
µ % = 2 0 1 0 m - m .100% (2.2) m - m Trong đó:
m0: khối lượng cốc nung
m1: khối lượng cốc nung và mẫu ban đầu m2: khối lượng cốc nung và tro
2.2.2. Khảo sát các yếu tố chiết tanin từ vỏ cây keo lá tràm
Dựa vào lượng tanin chiết ra theo các yếu tố khảo sát mà lựa chọn ra đâu là yếu tố tối ưu để đạt hiệu suất chiết cao nhất.
+ Định lượng theo phương pháp Lowenthal: phương pháp oxi hoá tanin bằng KMnO4 trong môi trường axit với chất chỉ thị sunfoindigocarmin sẽ tạo thành CO2
và H2O đồng thời làm mất màu xanh của nó
Phương trình phản ứng: Tanin + KMnO4Sunfoindigocarmin,H SO2 4 CO2 + H2O
a. Cách tiến hành chung
Pha dung dịch:
+ Pha 1,0 lít dung dịch KMnO4 0,1N:
Cân chính xác 3,10 g KMnO4 rắn, rồi hoà loãng trước trong cốc 500mL, sau đó chuyển hết vào bình định mức 1000mL (tráng đều cốc nhiều lần bằng nước cất) rồi tiếp tục chuẩn nước cất cho đến lúc chạm vạch lắc đều. (Lưu ý: trước khi làm các thí nghiệm dung dịch KMnO4 luôn được chuẩn hoá lại nồng độ để giảm thiểu tối đa các sai số có thể xảy ra trong quá trình làm thí nghiệm.)
+ Pha 1,0 lít dung dịch chất chỉ thị sunfoindigocarmin:
Cân 1,00 (g) indigocarmin cho vào cốc 100 mL sau đó thêm vào 25 mL H2SO4 (đặc), đậy cốc bằng nắp thu tinh sau đó chuyển vào chỗ tối trong khoảng 24
giờ, nhằm hoà tan hết lượng indigocarmin. Sau 24 giờ chuyển hết hỗn hợp vào bình định mức 1000 mL (tráng đều cốc nhiều lần bằng nước cất) rồi sau đó chuẩn nước cất đến chạm vạch rồi lắc đều, chuyển toàn bộ lượng dung dịch vừa pha vào bình tối màu để bảo quản dùng dần trong toàn bộ quá trình khảo sát.
Công thức xác định hàm lượng tanin trong mẫu:
1 2 0 X V -V .V .K X % = .100% (2.3) V .m Trong đó:
X( ) : hàm lượng tanin tính theo
V1:thể tích KMnO4 dùng để chuẩn mẫu phân tích. V2: thể tích KMnO4 dùng để chuẩn mẫu dung dịch trắng.
V0: thể tích tổng dung dịch ( trường hợp này chon bình định mức 250 mL) Vx:thể tích dịch chiết đem đi chuẩn độ.(chọn 10 mL).
K: hệ số khối lượng tanin có giá trị bằng 0,00582 ( nghĩa là 1mL dung dịch KMnO4 0,1N oxi hoá được 0,00582g tanin)
m: khối lượng tanin đem đi phân tích.(chọn 1g)
b. Tiến hành pha chế
Cụ thể: cân 1g nguyên liệu rồi chiết với một thể tích dung môi xác định sau đó để nguội hỗn hợp lọc; lấy dịch chiết đem dịch lọc đi định tính nhóm chức tanin bằng cách cho phản ứng với dung dịch FeCl3 5 nếu hỗn hợp từ màu nâu chuyển sang màu xanh hơi đen chứng tỏ trong dịch chiết có tanin tồn tại, tiến hành chuẩn độ.
- Bình thí nghiệm (Erlen 1): 10mL dịch chiết + 250 mL nước cất + 10 mL sunfoindigocarmin dung dịch lúc này sẽ có màu xanh tiến hành chuẩn độ với dung dịch KMnO4 cho đến khi dung dịch chuyển sang màu vàng rơm thì dừng lại.
- Bình mẫu trắng (Erlen 2): 250 mL nước cất +10 mL sunfoindigocarmin chuẩn bằng KMnO4 cho đến khi dung dịch từ mâu nâu chuyển sang không màu. Ghi kết quả thể tích dung dịch chuẩn độ và Tiến hành thí nghiệm trên với 3 lần chuẩn độ.
+ Nghiên cứu yếu tố nhiệt độ:
Quy trình làm việc: cân 1g bột mịn đem nấu cách thu với 50 mL nước cất tại các điều kiện nhiệt độ khác nhau thu dịch lọc đem đi chuẩn độ và ta thu kết quả.
+ Nghiên cứu yếu tố t lệ Rắn Lỏng (R L):
Quy trình làm việc: Khảo sát này bao gồm rất nhiều thí nghiệm mỗi thí nghiệm ta cân 1g nguyên liệu bột và nấu với các thể tích nước khác nhau ở 800C sau đó đem các dịch lọc này đi chuẩn độ lần lượt thu kết quả.
+ Nghiên cứu yếu tố thời gian:
Quy trình làm việc: tiến hành khảo sát với các thông số đã khảo sát ở trên. Cân 1g nguyên liệu nấu với 50 mL nước cất ở nhiệt độ 80oC trong các khoảng thời gian sau đó thu lấy dịch lọc đem đi chuẩn độ.
2.2.3. Tách sản phẩm tanin rắn và phân tích cấu trúc của tanin
- Khối lượng nguyên liệu cũng như dung môi được tăng lên gấp 10 lần, chiết bằng bộ chiết chưng ninh đồng thời với các điều kiện đã khảo sát được ở trên. Dung dịch sau khi chiết được xử lí với clorofom để loại hết chất béo sau đó được chiết lại bằng phễu chiết để tách phần dung dịch chứa tanin, dung dịch này được cô quay đuổi dung môi ta thu được tanin rắn.
- Đem mẫu tanin rắn đo phổ hồng ngoại Fourier (FTIR) tại phòng phân tích mẫu của trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng.
2.3. TỔNG HỢP NANO BẠC TỪ DỊCH CHIẾT TANIN TỪ VỎ CÂY KEO LÁ TRÀM
Quy trình khảo sát tổng hợp nano bạc từ tác nhân khử là tanin được chiết tách từ keo lá tràm theo Hình 2.2:
2.3.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp nano bạc
a. Nghiên cứu yếu tố t lệ rắn l ng:
- Pha chế dung dịch tanin 1,500g/1000 mL - Pha chế dung dịch AgNO3 1mM
- Khảo sát tỉ lệ lần lượt :1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 11 mL, 12 mL của dung dịch tanin bằng 30 mL AgNO3 1mM trong khoảng thời gian 2 giờ đem các mẫu đi phân tích phổ UV-Vis.
b. Nghiên cứu yếu tố nồng độ dung dịch tanin
Tiến hành:
- Pha chế dung dịch tanin 1g 1000 mL; 2g/1000 mL; 3g/1000 mL; 4g/1000 mL;5g/1000 mL.
- Pha chế dung dịch AgNO3 1mM
Lần lượt lấy 8 mL dung dịch khác nhau của tanin đem tác dụng với 30mL dung dịch AgNO3 1mM. Sau 2 giờ đồng hồ đem mẫu đi phân tích phổ UV-Vis chọn ra nồng độ dung dịch tanin tối ưu nhất.
c. Nghiên cứu yếu tố nhiệt độ
- Pha chế dung dịch tanin 2g /1000 mL - Pha chế dung dịch AgNO3 1 mM
Tiến hành với mẫu 8 mL dung dịch tanin và 30mL dung dịch AgNO3 1 mM, tất cả các mẫu tiến hành trong các mức nhiệt độ khác nhau (30oC; 40oC; 50oC; 60oC ;70oC; 80oC) trong suốt một khoảng thời gian 2 giờ, sau đó đem các mẫu đi phân tích phổ UV-Vis và lựa chọn ra nhiệt độ tối ưu.
d. Nghiên cứu yếu tố th i gian
- Pha chế dung dịch tanin 2g 1000 mL. - Pha chế dung dịch AgNO3 1 mM. - Chuẩn bị bếp ở nhiệt độ 40oC.
Tiến hành với các mẫu ở cùng điều kiện như nhau với tỉ lệ rắn lỏng tối ưu, sau khoảng thời gian đạt yêu cầu chọn mẫu tối ưu với thời gian. Phân tích phổ UV- Vis để chọn ra yếu tố tối ưu.
2.3.2. Các thiết bị xác định nhóm chức trong tanin, hạt nano bạc
a. Máy đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR)
Phương pháp phổ hồng ngoại có thể được ứng dụng trong phân tích định lượng một chất trong dung dịch hay trong hỗn hợp. Lấy khoảng 0,5g mẫu tanin rắn tách ra để xác định nhóm chức đặc trưng trong tanin có trong dịch chiết vỏ keo lá tràm.
b. Máy quang phổ hấp thu UV – Vis
Dùng để xác định độ tinh khiết của một hợp chất, nhận biết cấu trúc các chất, phân tích hỗn hợp... Khi tiến hành đo phổ của các mẫu ở các điều kiện nghiên cứu thì mỗi mẫu xác định điều kiện tối ưu khi nghiên cứu tổng hợp nano bạc và bước sóng của bạc khoảng 400 – 450 nm. Từ kết quả nhận được ta xác định được sơ bộ nano bạc được tổng hợp trong mỗi điều kiện. Qua đó chọn điều kiện tối ưu để tổng hợp nano bạc.
Đo UV – Vis tiến hành tại phòng thí nghiệm của khoa Hóa học, Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng.
c. Phương pháp đo kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Nhằm xác định chính xác kích thước hạt nano bạc tạo thành. Dựa vào ảnh chụp các phần tử nano bạc bằng kính hiển vi điện tử truyền qua chúng ta xác định được kích thước, hình dáng của hạt nano, sự phân bố hạt, đồng thời xem xét kích thước đó đảm bảo là tốt hay chưa. Đối với kính hiển vi điện tử truyền qua thì ảnh chụp sẽ không thể hiện phần chất bảo vệ quanh hạt nano bạc mà nó chỉ thể hiện phần lõi bạc kim loại của nano bạc.
Chúng tôi đo mẫu chuẩn bằng phương pháp đo kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) tại Phòng thí nghiệm siêu cấu trúc - Khoa vi rút - Viện vệ sinh dịch tể Trung ương, số 1 - Yersin - Hà Nội.
d. Máy đo phổ nhiễu xạ tia – XRD
Để xác định cấu trúc tinh thể nano bạc được tổng hợp từ tác nhân khử là tanin, chúng tôi tiến hành đo phổ nhiễu xạ tia X – XRD với mẫu rắn tanin.
Đo FTIR, XRD tại phòng phân tích mẫu của Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng.
e. Phân tích thành phần của vật chất EDX (EDS)
Kỹ thuật phân tích xác định thành phần của mẫu chất rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ mẫu vật rắn do tương tác với các bức xạ (chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử). được gọi là kỹ thuật phân tích EDX hay EDS (Energy-dispersive X-ray spectroscopy).
Ta tiến hành đo tinh thể nano bạc tổng hợp từ tanin ở điều kiện tối ưu tại Phòng thí nghiệm siêu cấu trúc - Khoa vi rút - Viện vệ sinh dịch tể Trung ương, số 1 - Yersin - Hà Nội, nhằm để xác định thành phần t lệ nguyên tố bạc có trong mẫu nano.
2.4. ỨNG DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA NANO BẠC TRONG BẢO QUẢN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG