6. Cấu trúc của luận văn
2.2.3. Tách sản phẩm tanin rắn và phân tích cấu trúc của tanin
- Khối lượng nguyên liệu cũng như dung môi được tăng lên gấp 10 lần, chiết bằng bộ chiết chưng ninh đồng thời với các điều kiện đã khảo sát được ở trên. Dung dịch sau khi chiết được xử lí với clorofom để loại hết chất béo sau đó được chiết lại bằng phễu chiết để tách phần dung dịch chứa tanin, dung dịch này được cô quay đuổi dung môi ta thu được tanin rắn.
- Đem mẫu tanin rắn đo phổ hồng ngoại Fourier (FTIR) tại phòng phân tích mẫu của trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng.
2.3. TỔNG HỢP NANO BẠC TỪ DỊCH CHIẾT TANIN TỪ VỎ CÂY KEO LÁ TRÀM
Quy trình khảo sát tổng hợp nano bạc từ tác nhân khử là tanin được chiết tách từ keo lá tràm theo Hình 2.2:
2.3.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp nano bạc
a. Nghiên cứu yếu tố t lệ rắn l ng:
- Pha chế dung dịch tanin 1,500g/1000 mL - Pha chế dung dịch AgNO3 1mM
- Khảo sát tỉ lệ lần lượt :1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 11 mL, 12 mL của dung dịch tanin bằng 30 mL AgNO3 1mM trong khoảng thời gian 2 giờ đem các mẫu đi phân tích phổ UV-Vis.
b. Nghiên cứu yếu tố nồng độ dung dịch tanin
Tiến hành:
- Pha chế dung dịch tanin 1g 1000 mL; 2g/1000 mL; 3g/1000 mL; 4g/1000 mL;5g/1000 mL.
- Pha chế dung dịch AgNO3 1mM
Lần lượt lấy 8 mL dung dịch khác nhau của tanin đem tác dụng với 30mL dung dịch AgNO3 1mM. Sau 2 giờ đồng hồ đem mẫu đi phân tích phổ UV-Vis chọn ra nồng độ dung dịch tanin tối ưu nhất.
c. Nghiên cứu yếu tố nhiệt độ
- Pha chế dung dịch tanin 2g /1000 mL - Pha chế dung dịch AgNO3 1 mM
Tiến hành với mẫu 8 mL dung dịch tanin và 30mL dung dịch AgNO3 1 mM, tất cả các mẫu tiến hành trong các mức nhiệt độ khác nhau (30oC; 40oC; 50oC; 60oC ;70oC; 80oC) trong suốt một khoảng thời gian 2 giờ, sau đó đem các mẫu đi phân tích phổ UV-Vis và lựa chọn ra nhiệt độ tối ưu.
d. Nghiên cứu yếu tố th i gian
- Pha chế dung dịch tanin 2g 1000 mL. - Pha chế dung dịch AgNO3 1 mM. - Chuẩn bị bếp ở nhiệt độ 40oC.
Tiến hành với các mẫu ở cùng điều kiện như nhau với tỉ lệ rắn lỏng tối ưu, sau khoảng thời gian đạt yêu cầu chọn mẫu tối ưu với thời gian. Phân tích phổ UV- Vis để chọn ra yếu tố tối ưu.
2.3.2. Các thiết bị xác định nhóm chức trong tanin, hạt nano bạc
a. Máy đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR)
Phương pháp phổ hồng ngoại có thể được ứng dụng trong phân tích định lượng một chất trong dung dịch hay trong hỗn hợp. Lấy khoảng 0,5g mẫu tanin rắn tách ra để xác định nhóm chức đặc trưng trong tanin có trong dịch chiết vỏ keo lá tràm.
b. Máy quang phổ hấp thu UV – Vis
Dùng để xác định độ tinh khiết của một hợp chất, nhận biết cấu trúc các chất, phân tích hỗn hợp... Khi tiến hành đo phổ của các mẫu ở các điều kiện nghiên cứu thì mỗi mẫu xác định điều kiện tối ưu khi nghiên cứu tổng hợp nano bạc và bước sóng của bạc khoảng 400 – 450 nm. Từ kết quả nhận được ta xác định được sơ bộ nano bạc được tổng hợp trong mỗi điều kiện. Qua đó chọn điều kiện tối ưu để tổng hợp nano bạc.
Đo UV – Vis tiến hành tại phòng thí nghiệm của khoa Hóa học, Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng.
c. Phương pháp đo kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Nhằm xác định chính xác kích thước hạt nano bạc tạo thành. Dựa vào ảnh chụp các phần tử nano bạc bằng kính hiển vi điện tử truyền qua chúng ta xác định được kích thước, hình dáng của hạt nano, sự phân bố hạt, đồng thời xem xét kích thước đó đảm bảo là tốt hay chưa. Đối với kính hiển vi điện tử truyền qua thì ảnh chụp sẽ không thể hiện phần chất bảo vệ quanh hạt nano bạc mà nó chỉ thể hiện phần lõi bạc kim loại của nano bạc.
Chúng tôi đo mẫu chuẩn bằng phương pháp đo kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) tại Phòng thí nghiệm siêu cấu trúc - Khoa vi rút - Viện vệ sinh dịch tể Trung ương, số 1 - Yersin - Hà Nội.
d. Máy đo phổ nhiễu xạ tia – XRD
Để xác định cấu trúc tinh thể nano bạc được tổng hợp từ tác nhân khử là tanin, chúng tôi tiến hành đo phổ nhiễu xạ tia X – XRD với mẫu rắn tanin.
Đo FTIR, XRD tại phòng phân tích mẫu của Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng.
e. Phân tích thành phần của vật chất EDX (EDS)
Kỹ thuật phân tích xác định thành phần của mẫu chất rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ mẫu vật rắn do tương tác với các bức xạ (chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử). được gọi là kỹ thuật phân tích EDX hay EDS (Energy-dispersive X-ray spectroscopy).
Ta tiến hành đo tinh thể nano bạc tổng hợp từ tanin ở điều kiện tối ưu tại Phòng thí nghiệm siêu cấu trúc - Khoa vi rút - Viện vệ sinh dịch tể Trung ương, số 1 - Yersin - Hà Nội, nhằm để xác định thành phần t lệ nguyên tố bạc có trong mẫu nano.
2.4. ỨNG DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA NANO BẠC TRONG BẢO QUẢN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TÔM THẺ CHÂN TRẮNG
- Tôm được mua vào khoảng sáng sớm ở chợ đầu mối. Để đảm bảo tối đa sự tươi sống của tôm, mua khoảng 200 gam và chọn ra những con tôm có kích thước gần xấp xỉ nhau và được bảo quản trong tủ đá của phòng thí nghiệm B2 của khoa Hóa Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
- Pha dung dịch nano bảo quản tôm được pha chế theo các thông số chuẩn đã khảo sát:
- Tỉ lệ thể tích dung dịch tanin/AgNO3 (theo mL): 8/30 - Nồng độ chất rắn tanin 2,000g/1000 mL
- Thời gian 4 giờ - Nhiệt độ 400C
- Tiến hành lấy 2 đĩa petri ngâm tôm trong cùng điều kiện khách quan bên ngoài,1 đĩa đựng nước thường,1 đĩa đựng dung dịch nano chuẩn. Sau 4 giờ ta quan sát hai mẫu tôm ngâm trong nước và nano bạc. Tiếp tục quan sát hai mẫu sau 24 giờ.
2.5. ỨNG DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI VI KHUẨN E.COLI E.COLI
2.5.1. Nuôi cấy vi khuẩn E.coli
Tiến hành nuôi cấy các loại vi khuẩn trên tại phòng thí nghiệm tại phòng thí nghiệm của khoa Sinh của trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
+ Chuẩn bị môi trường:
- Môi trường LB : ( dùng cho 1lit môi trường) - Peptone: 10g
- NaCl:10g
- Cao nấm men:5g - Thạch Agar: 20g - pH = 7.0
Môi trường được hấp tiệc trùng ở 1210
C với thời gian 20 phút trong nồi hấp, sau đó cho môi trường vào đĩa petri, khoảng 20mL đĩa
+ Cấy:
- Tiến hành cấy trang giống E.Coli đã chuẩn bị trước, trải 100 l vi khuẩn E. Coli lên môi trường và trang đều đĩa petri.
+ Đục giếng thạch:
- Tiến hành đục giếng thạch trên đĩa petri,mỗi giếng có đường kính 6 – 10 mm;
2.5.2. Chuẩn bị dung dịch nano bạc theo các thông số chuẩn đã khảo sát
Tỉ lệ tanin AgNO3 (mL): 8/30; Nồng độ chất rắn tanin 2g 1000 mL; Thời gian 4 giờ;
Nhiệt độ 400C.
2.5.3. Tiến hành nhỏ giọt nano bạc pha chế vào các giếng thạch
- Nhỏ trực tiếp mẫu vào giếng, chú ý không để mẫu tràn ra ngoài miệng giếng;
sau 24 giờ (Trong quá trình ủ không được làm dịch chiếc đổ ra khỏi miệng giếng ). Ta có công thức tính hiệu quả kháng khuẩn:
C = D – d . Trong đó: C: đường kính vòng vô khuẩn (mm)
D: đường kính vòng sáng xung quanh giếng thạch (mm) d: đường kính giếng thạch (mm).
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH TANIN TỪ VỎ CÂY KEO LÁ TRÀM. 3.1.1. ác định độ ẩm (W%)
Tiến hành sấy cốc cân sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 100 C đến trọng lượng không đổi (dùng cân phân tích để cân lại đến khi khối lượng không đổi với giá trị 10,000 (g)), đưa vào cốc chính xác 2,000 g bột vỏ keo lá tràm, đem cân trên cân phân tích và ghi nhận giá trị cốc lẫn bột có khối lượng m1 = 12,00(g).
- Đặt mẫu vừa cân vào tủ sấy ở nhiệt độ 100 C tiếp tục sấy khoảng 5 giờ liên tục. Sau lấy cốc ra để cốc giảm nhiệt độ đồng thời đưa vào bình hút ẩm khoảng 15- 20 phút, rồi cân cốc này trên cân phân tích.
-Tiếp tục sấy cốc này trong tủ sấy khoảng 2 giờ đồng hồ,tiếp tục cân mẫu này,lần lượt thực hiện lại các bước này cho đến khi khối lượng cốc giữa các lần sấy là không đổi. Ghi nhận giá trị này là m2
Thực hiện ba lần ta được kết quả về số liệu độ ẩm ở Bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm ( W% ) bột tanin STT Khối lƣợng bột keo(g)=( m1- m0) khối lƣợng cốc và mẫu chƣa sấy (g) m1 Khối lƣợng cốc và mẫu sau khi đã sấy (g) m2 W(%) 1 2,00 12,00 11,75 12,50 2 2,00 12,00 11,76 12,25 3 2,00 12,00 11,75 12,30 Trung bình 2,00 12,00 11,74 12,35
Độ ẩm trung bình của bột vỏ keo lá tràm W(%) = 12,35
3.1.2. ác định hàm lƣợng tro (µ % )
Tiến hành làm sạch rồi sấy khô cốc ở nhiệt độ 105oC khoảng 30 phút sau đó nung lại bằng lò nung cùng nhiệt độ và thời gian trên, sau đó lấy ra làm nguội trong
bình hút ẩm và cân cốc (quá trình nung cốc được làm lặp lại cho đến khi khối lượng cốc là không đổi).
- Đốt mẫu trên bếp điện để chuyển toàn bộ vỏ keo lá tràm hóa than.
Tiếp tục nung mẫu trong lò nung đến khi thu được tro màu trắng ngà, làm nguội trong bình hút ẩm và nung lặp đi lặp lại cho đến khi khối lượng không đổi.
Thực hiện hai lần, được kết quả ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lượng tro ( µ %) của bột v keo lá tràm
STT m0 m1 m2 Kết quả trung bình ( )
1 29,80 39,81 31,13 13,28
13,23 %
2 31,72 41,73 33,04 13,18
Vậy mẫu bột vỏ keo lá tràm có hàm lượng tro là 13,23%
3.1.3. Ảnh hƣởng kích thƣớc nguyên liệu đến hiệu suất tách tanin
Kích thước là một trong những yếu tố có vai trò quyết định trong quá trình chiết tách tanin. Nếu chọn được kích thước tối ưu sẽ nâng cao hiệu quả của quá trình chiết tách. Vật liệu rắn có kích thước càng nhỏ thì khả năng chiết càng lớn do diện tích tiếp xúc giữa chúng và dung môi tăng lên tạo điều kiện cho quá trình chiết dễ dàng hơn.
Tiến hành các thí nghiệm như sau: lấy mẫu vỏ keo lá tràm đã sấy ở nhiệt độ 1000C cho vào mỗi cốc các loại vỏ keo lá tràm với kích thước khác nhau. Cụ thể: 3 – 5 cm, 2 – 3 cm, 1 – 2 cm, 2 – 3 mm, hạt 0,01 – 0,05 mm (dạng bột). Cho vào mỗi cốc 800mL nước cất, rồi đun từng cốc ở 800C trong 1 giờ.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất tách tanin được trình bày ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu
Nhận x t: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước vỏ keo lá tràm đến hiệu suất chiết tách tanin được trình bày ở Hình 3.1, từ đồ thị cho thấy, các mức kích thước khác nhau khi chiết sẽ cho hàm lượng tanin cách biệt nhau rõ rệt, nguyên liệu bột mịn cho kết quả chiết là cao nhất với kích thước này là sự gia tăng đáng kể diện tích tiếp xúc bề mặt của nguyên liệu và dung môi so với các kích thước còn lại làm cho việc chiết được tanin của nguyên liệu mịn có có hiệu suất khá cao. Vì vậy chọn kích thước nguyên liệu hạt (0,01 – 0,05 mm ) mịn làm kích thước chính để tiến hành các phản ứng sau này.
3.1.4. Ảnh hƣởng yếu tố nhiệt độ
Tiến hành như mục b của 2.1.3, xét tại các nhiệt độ khác nhau: 50o, 60o, 70o, 80o, 90o, 100oC. Ta thấy ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tách tanin từ nguyên liệu bột vỏ keo lá tràm thể hiện ở Hình 3.2.
Hình 3.2. Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ (0C ) đến hiệu suất tách tanin
Nhận x t: Qua đồ thị của Hình 3.2, có thể cho thấy rằng nhiệt độ càng tăng thì lượng tanin chiết được càng tăng cho đến lúc đạt được 800C thì lượng tanin bắt đầu giảm điểu này có thể giải thích được tại nhiệt độ 800C thì lượng tanin là cao nhất và khi nhiệt độ vượt ngưỡng 800C thì tanin bắt đầu giảm. Có thể giải thích là do khi nhiệt độ tăng thì thuận lợi cho việc phá hủy màng tế bào thực vật và tăng độ hòa tan tanin, dẫn đến tăng hiệu quả chiết tách. Ngoài ra, ở nhiệt độ trên 800
C thì một phần tanin bị thủy phân tạo thành những chất khác không phải tanin, nên làm lượng tanin giảm ở nhiệt độ quá cao.
Vì vậy chọn mức nhiệt độ 80oC làm nhiệt độ tối ưu.
3.1.5. Ảnh hƣởng yếu tố tỷ lệ Rắn Lỏng (R L)
Tiến hành như ý hai, mục b của 2.1.3 ta được thấy ảnh hưởng của t lệ chất rắn và dung môi đến hiệu suất chiết tách tanin thu được kết quả ở Hình 3.3
Hình 3.3. Ảnh hưởng của yếu tố R L đến hiệu suất tách tanin
Nhận x t: Từ đồ thị của Hình 3.3, ta dễ dàng thấy nếu chiết 1,000g nguyên liệu với 50mL nước cho được lượng tanin là cao nhất còn lại ở các mức dung môi cao hơn thì lượng tanin tách ra giảm.
Nguyên nhân là do khi lượng dung môi nước tăng lên thì khả năng tiếp xúc với nguyên liệu càng lớn và lượng tanin tách ra càng nhiều, nhưng dùng lượng dung môi quá lớn thì tanin cũng không tách thêm vì lúc đó tanin có trong vỏ keo lá tràm hầu như đã được tách hoàn toàn. Mặt khác, khi dung môi nước tăng đã gián tiếp làm các cấu tử lạ tách ra theo nhanh hơn làm ảnh hưởng đến sản phẩm tạo thành.
Vì vậy chọn tỉ lệ 1,000g/50mL làm tỉ lệ chiết tốt nhất.
3.1.6. Ảnh hƣởng yếu tố thời gian
Cân 1,000g nguyên liệu bột vỏ keo lá tràm rồi đun với 50 mL nước cất ở nhiệt độ 80oC trong các khoảng thời gian từ 30 phút đến 70 phút theo bảng sau đó thu lấy dịch lọc đem đi chuẩn độ. Kết quả thể hiện ở Hình 3.4.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của th i gian đến hiệu suất tách tanin.
Nhận x t: Từ đồ thị của Hình 3.4, cho thấy thời gian càng tăng thì lượng tanin tách ra càng tăng, cho đến 50 phút thì đạt giá trị ổn định. Tuy nhiên khi thời gian kéo dài thêm thì lượng tanin lại giảm điều này có thể giải thích: thời gian càng lớn thì lượng tanin tách ra tăng, nhưng từ 60 phút trở lên thì ngoài tanin tách ra, còn có sự hòa tan một số chất hữu cơ tan chậm trong nước, cản trở sự tách tanin ra khỏi vỏ keo lá tràm hay có sự thủy phân xảy ra ở các tanin thủy phân và sự polyme hóa ở điều kiện nhiệt độ 800
C.
Vì vậy chọn khoảng thời gian chiết là 50 phút làm thời gian chiết tối ưu.
Tóm lại: đi u kiện tối ưu để chiết tanin từ vỏ cây keo lá tràm là
- Kích thước nguyên liệu là bột mịn - Nhiệt độ: 80oC
- Tỉ lệ rắn : lỏng là 1,00g : 50mL - Thời gian: 50 phút
Với đi u kiện này thì lượng tanin tách ra với hiệu suất 16,005%
3.1.7. Phân tích sản phẩm tanin
Tiến hành ly tâm tách tanin rắn từ điều kiện tối ưu, rồi đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), kết quả thu được từ phổ đồ theo Hình 3.5.
Nhận x t: Quan sát từ phổ đồ ta có bước sóng cụ thể của từng loại dao động của các nhóm chức đặc trưng ở Bảng 3.3:
Bảng 3.3. Phân tích các dao động từ phổ đồ
Số sóng
(cm-1) Loại dao động Cƣờng độ peak (%)
629 Dao động biến dạng CH của nhân thơm 59,495