4.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
Nghiên cứu được tập trung vào các gene ORF5 và ORF7 của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Gene ORF5 mã hóa glycoprotein vỏ chính của virus – GP5 có tính kháng nguyên mạnh và chịu trách nhiệm gây bệnh của virus PRRS. Gene ORF7 mã hóa protein N. Protein GP5 cùng với protein N là đích chủ yếu của kháng thể trung hòa, tham gia cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ với virus (Han et al., 2009; Zhang et al., 2013). Một vài peptide/protein chủ đạo như peptide tín hiệu, vùng xuyên màng, yếu tố quyết định kháng nguyên và điểm glycosyl hóa đã được xác nhận trên GP5. Vì vậy đoạn gene ORF5 và ORF7 đã được sử dụng rộng rãi để phân tích sự biến đổi di truyền và dịch tễ học phân tử của virus PRRS.
Để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS- 01 và KTY-PRRS-02 cần tiến hành giải trình tự các gene trên, so sánh trình tự gene, trình tự amino acidcủa các gene này với nhau và với một số chủng virus PRRS tham chiếu đã được đăng kí trên ngân hàng gene, xây dựng cây phát sinh loài dựa trên trình tự nucleotide để thấy được mối quan hệ di truyền của các chủng virus nghiên cứu.
4.2.1. Kết quả phản ứng RT-PCR
Sau khi tách chiết RNA từ các chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY- PRRS-02, tiến hành thực hiện phản ứng RT-PCR lần lượt với các cặp mồi khuếch đại gene ORF5 và ORF7.
Cặp mồi khuếch đại gene ORF5 cho phép khuếch đại đoạn gene có kích thước 720bp của virus PRRS, trong đó có chứa đoạn gene ORF5 có kích thước là 603bp mã hóa cho Glycoprotein 5 (GP5).
Cặp mồi khuếch đại gene ORF7 cho phép khuếch đại đoạn gene có kích thước 372bp của virus PRRS mã hoá cho protein N của virus.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng RT-PCR được thể hiện ở hình 4.11.
A B
Hình 4.11. Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF7 (hình A) và ORF5 (hình B)
[Hình A: Đoạn gene ORF7 có kích thước 372bp; Hình B: Đoạn gene ORF5 có kích thước 720bp, thang chuẩn M 100bp; Từ trái qua phải: giếng 1:KTY-PRRS-01, giếng 2: KTY-PRRS-02, giếng
3: đối chứng âm, giếng 4: đối chứng dương]
Qua hình A, B là kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR của 02 chủng nghiên cứu với lần lượt cặp mồi ORF7 và cặp mồi ORF5. Vạch band DNA phát sáng có kích thước bằng 372bp trùng đúng với thiết kế của đoạn mồi ORF7 và 720 bp trùng đúng với thiết kế của cặp mồi ORF5.
4.2.2. Kết quả giải trình tự gene của các chủng virus PRRS nghiên cứu
Từ sản phẩm PCR thu được, tiến hành tinh sạch bằng Kit tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Qiagen. Sản phẩm tinh sạch sẽ tiếp tục được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR sequence và tinh sạch bằng cồn, sau đó tiến hành giải trình tự gene. Quá trình giải trình tự được thực hiện bằng máy giải trình tự Beckman Coulter CEQ 8000 của Mỹ tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y.
Kết quả cho thấy chất lượng giải trình tự tốt, mỗi đỉnh màu của giản đồ đều xác nhận một loại nucleotide, các nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng trong đó Adenin cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu đen. Chuỗi nucleotide thu được sau khi giải trình tự được xử lý bằng các phần mềm Genetyx trên máy tính. Sau khi phân tích chúng tôi thu được toàn bộ chuỗi gene của đoạn ORF7 có độ dài 372bp và chuỗi gene của đoạn ORF5 có độ dài 603bp. Như vậy việc tách chiết RNA tổng số, quá trình thực hiện RT-PCR và giải trình tự đã được thực hiện thành công.
372pb
4.2.3. Kết quả truy cập ngân hàng gene
4.2.3.1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn ORF7 giữa 02 chủng virus nghiên cứu và một số chủng tham chiếu
Từ kết quả giải trình tự gene ORF7 của 02 chủng virus nghiên cứu KTY- PRRS-01 và KTY-PRRS-02, qua phân tích và xử lý tín hiệu trình tự gene thu được bằng phần mềm SEQ 8000 và Genetyx đã thu được trình tự nucleotide của đoạn của đoạn ORF7 có độ dài 372bp. Tiến hành so sánh trình tự của 02 chủng virus nghiên cứu này với nhau để tìm ra mức độ tương đồng về gene ORF7 giữa 2 chủng này. Bên cạnh đó chúng tôi đã đưa thêm một số chủng tham chiếu trên ngân hàng gene thế giới như: Chủng độc lực cao được phân lập tại Trung Quốc JXA1, chủng virus tham chiếu gốc Bắc Mỹ VR2332, 02 chủng virus độc lực cao DN444 được phân lập năm 2008 và CT.C1 được phân lập năm 2012 tại Việt Nam để phân tích, so sánh thấy được mối quan hệ di truyền tổng thể của các chủng nghiên cứu và các chủng trên thế giới. Kết quả so sánh tương đồng nucleotide giữa các chủng nghiên cứu và chủng virus tham chiếu được thể hiện ở hình 4.12 và bảng 4.6.
Hình 4.12. Kết quả so sánh trình tự gene ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu
Kết quả cho thấy trình tự gene ORF7 của 2 chủng virus PRRS nghiên cứu được giải trình tự gene có sự sai khác về thành phần nucleotide với nhau và khác so với các chủng virus tham chiếu. Đoạn gene ORF7 qua xử lý trình tự gene thu được đoạn gene có độ dài 372bp ở 2 chủng nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Qua việc so sánh trình tự nucleotide giữa 2 chủng virus PRRS và chủng virus tham chiếu, nghiên cứu đã chỉ ra được 32 vị trí sai khác về nucleotide được trình bày ở bảng 4.6.
Bảng 4.6. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF7 giữa các chủngvirus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu
TT Vị Trí Nucleotide sai khác TT Vị Trí Nucleotide sai khác TT Vị Trí Nucleotide sai khác 1 12 T – C 12 137 G – A 23 255 G - A 2 27 A – G 13 165 C – T 24 264 A - G 3 32 A – G 14 171 T - A 25 270 T - C 4 43 A – G 15 186 C – T 26 271 G - A 5 72 A – G 16 192 G – A 27 321 T - G 6 81 T – C 17 213 G – A 28 327 A – T 7 93 C – T 18 216 G – A 29 330 T - C 8 96 A – G 19 234 G – A 30 339 T - C 9 102 C - T 20 240 G – A 31 345 T – C 10 126 G – A 21 243 T – C 32 350 C – T 11 135 T – C 22 249 C – T
Sai khác về trình tự nucleotide của đoạn gene ORF7 giữa 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02tại 5 vị trí: vị trí số 12 (T-C), vị trí số 171 (T- A), vị trí số 240 (G-A), vị trí số 321 (T-G) và vị trí số 345 (T-C).
Sự sai khác trình tự nucleotide của đoạn gene ORF7 giữa chủng virus KTY-PRRS-01 và chủng virus JXA1 được thể hiện ở 4 vị trí: vị trí số 13 (T-C), vị trí số 171 (T-A), vị trí số 321 (T-G), và vị trí số 345 (T-C), tổng vị trí sai khác giữa hai chủng virus này chiếm 1,08% tổng số nucleotide của đoạn gene. Sự sai khác trình tự nucleotide giữa KTY-PRRS-01 với chủng virus VR2332 được thể hiện ở 24 vị trí: vị trí số 12 (T-C), vị trí số 27 (A-G), vị trí số 32 (A-G), vị trí 43 (A-G), vị trí số 72 (A-G), vị trí số 93 (C-T), vị trí số 96 (A-G), vị số 126 (G-A),
vị trí số 137 (G-A), vị trí số 165 (C-T), vị trí số 171 (A-T), vị trí số 186 (C-T), vị trí số 192 (G-A), vị trí số 234 (G-A), vị trí số 243 (T-C), vị trí 249 (C-T), vị trí số 255 (G-A), vị trí số 264 (A-G), vị trí số 270 (T-C), vị trí số 271 (G-A), vị trí số 327 (A-T), vị trí số 339 (T-C), vị trí 345 (C-T), vị trí số 350 (C-T).
Sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn gene ORF7 giữa chủng virus KTY-PRRS-02 với chủng virus JXA1 được thể hiện ở 1 vị trí 240 (A-G) chiếm 0,27% tổng trình tự của gene ORF7. Sự sai khác trình tự nucleotide giữa chủng virus KTY-PRRS-02 với chủng virus VR2332 cho thấy ở 23 vị trí: vị trí 27 (A- G), vị trí 32 (A-G), vị trí 43 (A-G), vị trí 72 (A-G), vị trí 93 (C-T), vị trí 96 (A- G), vị trí 126 (G-A), vị trí 137 (G-A), vị trí 165 (C-T), vị trí 186 (C-T), vị trí 192 (G-A), vị trí 234 (G-A), vị trí 240 (G-A), vị trí 243 (T-C), vị trí 249 (C-T), vị trí 255 (G-A), vị trí 264 (A-G), vị trí 270 (T-C), vị trí 271 (G-A), vị trí 321 (G-T), vị trí 327 (A-T), vị trí 339 (T-C), vị trí 350 (C-T).
Kết quả cho thấy 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 không có nhiều điểm sai khác với nhau về trình tự nucleotide. Sự sai khác giữa các chủng 2 chủng virus nghiên cứu với chủng virus JXA1 thấp hơn so với chủng VR2332. Như vậy có thể thấy sự tương đồng về nucleotide giữa 2 chủng virus nghiên cứu với chủng Trung Quốc JXA1 là tương đối cao.
4.2.3.2. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn ORF5 giữa 02 chủng virus nghiên cứu và một số chủng tham chiếu
Từ kết quả giải trình tự gene ORF5 của 02 chủng virus nghiên cứu KTY- PRRS-01 và KTY-PRRS-02cùng với nguồn tham khảo trình tự của các chủng trên ngân hàng gene thế giới bao gồm: chủng độc lực cao Trung Quốc- JAX1, chủng tham chiếu gốc Bắc Mỹ ATCC_VR2332 và 02 chủng virus độc lực cao DN444 được phân lập năm 2008 và CT.C1được phân lập năm 2012 tại Việt Nam để phân tích. Tiến hành so sánh trình tự của 02 chủng nghiên cứu này với nhau để tìm ra mức độ tương đồng về gene ORF5 giữa các chủng này. Bên cạnh đó chúng tôi đã đưa thêm các chủng tham chiếu nêu trên để phân tích, so sánh thấy được mối quan hệ di truyền tổng thể của các chủng nghiên cứu và các chủng trên thế giới. Kết quả giải trình tự gene đoạn gene ORF5 của các chủng virus nghiên cứu và chủng virus vắc xin được trình bày ở hình 4.13.
Hình 4.13. Kết quả so sánh trình tự gene ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu
Kết quả cho thấy trình tự gene ORF5 của 2 chủng virus nghiên cứu được giải trình tự gene có sự sai khác tương đối về thành phần nucleotide với nhau và khác so với chủng virus tham chiếu. Đoạn gene ORF5 qua xử lý trình tự gene thu được đoạn gene có độ dài 603bp ở 2 chủng nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Qua việc so sánh trình tự nucleotide giữa 2 chủng virus PRRS và chủng virus tham chiếu, nghiên cứu đã chỉ ra được 81 vị trí sai khác về nucleotide được trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF5 giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu
TT Vị trí Nucleotide sai khác TT Vị trí Nucleotide sai khác TT Vị trí Nucleotide sai khác 1 8 G – A 28 216 G - T 55 384 G – A 2 12 G – A 29 231 T – C 56 390 C – T 3 25 T – G 30 240 G – A 57 409 T – G 4 47 T – C 31 240 G - T 58 411 T – G 5 71 A – G 32 243 A – C 59 431 T - C 6 73 C – T 33 246 C – T 60 432 C – T 7 86 T – C 34 249 C - T 61 444 C - T
TT Vị trí Nucleotide sai khác TT Vị trí Nucleotide sai khác TT Vị trí Nucleotide sai khác 8 97 G - A 35 273 T – C 62 447 G – A 9 100 A – G 36 275 G – C 63 471 G – A 10 101 A – G 37 277 C – T 64 474 C – T 11 104 A – G 38 279 G – A 65 480 T – C 12 111 T – C 39 281 C – T 66 481 G – A 13 115 A – C 40 291 C – T 67 483 G – A 14 117 T – A 41 300 A – G 68 490 G – A 15 121 T - C 42 302 A – T 69 495 T – C 16 129 T – C 43 304 T – G 70 498 G – A 17 135 A – G 44 305 A – T 71 511 C – G 18 168 G – A 45 310 G - A 72 516 C – T 19 171 A – T 46 322 T – C 73 519 G - C 20 171 A – G 47 324 G – A 74 529 C – A 21 172 C - A 48 333 T – C 75 531 G – A 22 174 A – C 49 339 A – G 76 542 C – T 23 177 T – A 50 348 T – C 77 554 C – T 24 183 C – T 51 358 C – T 78 565 T – A 25 189 A – G 52 362 T – C 79 587 T – A 26 197 C – G 53 369 T – C 80 599 T – C 27 210 C - T 54 379 C – T 81 600 C – T
Như vậy, khi so sánh về thành phần nucleotide ở đoạn gene ORF7 giữa hai chủng nghiên cứu và các chủng tham chiếu thì các chủng này có độ sai khác về nucleotide là 8,60% tổng số các nucleotide và ở đoạn gene ORF5 là 13,43% tổng số các nucleotide. Điều này sẽ dẫn đến các chủng virus trong cùng một nhánh phát sinh sẽ có ít sự sai khác về trình tự nucleotide.
Sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn gene ORF5 giữa 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 được thể hiện ở 11 vị trí: vị trí 29 (A-G), vị trí 86 (C-T), vị trí 101 (G-A), vị trí 240 (A-G), vị trí 279 (A-G), vị trí 432 (C- T), vị trí 447 (A-G), vị trí 471 (A-G), vị trí 490 (A – G), vị trí 500 (G-T), vị trí 519 (C-G).
So sánh về trình tự nucleotide của gene ORF5 giữa chủng virus KTY- PRRS-01 với chủng phân lập tại Trung Quốc JXA1 cho thấy 10 vị trí sai khác: vị trí 29 (A-G), vị trí 86 (C-T), vị trí 101 (G-A), vị trí 240 (A-G), vị trí 279 (A-G), vị trí 447 (A-G), vị trí 471 (A-G), vị trí 490 (A-G), vị trí 500 (G-T), vị trí 587 (A- T). Trình tự nucleotide giữa chủng virus KTY-PRRS-01 và chủng virus VR2332 có sự sai khác ở 66 vị trí sau: vị trí số 8 (G-A), vị trí 12 (G-A), vị trí 25 (T-G), vị trí 29 (A-G), vị trí 47 (T-C), vị trí 71 (A-G), vị trí 73 (C-T), vị trí 100 (A-G), vị trí 101 (G-A), vị trí 104 (A-G), vị trí 111 (T-C), vị trí 115 (A-C), vị trí 117 (T-A), vị trí 121 (T-C), vị trí 129 (T-C), vị trí 135 (A-G), vị trí 168 (G-A), vị trí 171 (A- T), vị trí 172 (C-A), vị trí 174 (A-C), vị trí 183 (C-T), vị trí 197 (C-G), vị trí 210 (C-T), vị trí 216 (G-T), vị trí 231 (T-C), vị trí 240 (A-T), vị trí 243 (A-C), vị trí 249 (C-T), vị trí 273 (T-C), vị trí 275 (G-C), vị trí 277 (C-T), vị trí 281 (C-T), vị trí 291 (C-T), vị trí 300 (A-G), vị trí 302 (A-T), vị trí 304 (T-G), vị trí 305 (A-T), vị trí 322 (T-C), vị trí 324 (G-A), vị trí 333 (T-C), vị trí 339 (A-G), vị trí 348 (T- C), vị trí 358 (C-T), vị trí 362 (T-C), vị trí 369 (T-C), vị trí 379 (C-T), vị trí 384 (G-A), vị trí 390 (C-T), vị trí 409 (T-G), vị trí 411 (T-G), vị trí 432 (C-T), vị trí 447 (A-G), vị trí 471 (A-G), vị trí 474 (C-T), vị trí 480 (T-C), vị trí 481 (G-A), vị trí 483 (G-A), vị trí 495 (T-C), vị trí 498 (G-A), vị trí 500 (G-T), vị trí 516 (C-T), vị trí 531 (G-A), vị trí 554 (C-T), vị trí 565 (T-A), vị trí 599 (T-C), vị trí 600 (C- T). Qua kết quả so sánh về sự sai khác nucleotide giữa chủng virus KTY-PRRS- 01 với chủng của Trung Quốc JXA1 và chủng Bắc Mỹ VR2332 cho thấy chủng KTY-PRRS-01 có sự sai khác về nucleotide với chủng VR2332 nhiều hơn so với chủng Trung Quốc. Điều này thể hiện mối quan hệ gần gũi của chủng virus JXA1 với chủng virus KTY-PRRS-01.
So sánh về trình tự nucleotide của gene ORF5 giữa chủng virus KTY- PRRS-02 với chủng Trung Quốc JXA1 thấy có 3 vị trí sai khác sau: vị trí số 431 (C-T), vị trí số 519 (C- G), vị trí 587 (A-T). So sánh với sự sai khác về trình tự nucleotide của gene ORF5 giữa chủng virus KTY-PRRS-02 với chủng virus Bắc Mỹ VR2332 cho thấy sự sai khácở 66 vị trí: vị trí số 8 (G-A), vị trí 12 (G-A), vị trí 25 (T-G), vị trí 47 (T-C), vị trí 71 (A-G), vị trí 73 (C-T), vị trí 86 (T-C), vị trí 100 (A-G), vị trí 104 (A-G), vị trí 111 (T-C), vị trí 115 (A-C), vị trí 117 (T-A), vị trí 121 (T-C), vị trí 129 (T-C), vị trí 135 (A-G), vị trí 168 (G-A), vị trí 171 (A-T), vị trí 172 (C-A), vị trí 174 (A-C), vị trí 183 (C-T), vị trí 197 (C-G), vị trí 210 (C-
T), vị trí 216 (G-T), vị trí 231 (T-C), vị trí 240 (G-T), vị trí 243 (A-C), vị trí 249 (C-T), vị trí 273 (T-C), vị trí 275 (G-C), vị trí 277 (C-T), vị trí 279 (G-A), vị trí 281 (C-T), vị trí 291 (C-T), vị trí 300 (A-G), vị trí 302 (A-T), vị trí 304 (T-G), vị trí 305 (A-T), vị trí 322 (T-C), vị trí 324 (G-A), vị trí 333 (T-C), vị trí 339 (A-G), vị trí 348 (T-C), vị trí 358 (C-T), vị trí 362 (T-C), vị trí 369 (T-C), vị trí 379 (C- T), vị trí 384 (G-A), vị trí 390 (C-T), vị trí 409 (T-G), vị trí 411 (T-G), vị trí 431 (C-T), vị trí 432 (C-T), vị trí 474 (C-T), vị trí 480 (T-C), vị trí 481 (G-A), vị trí 483 (G-A), vị trí 490 (G-A), vị trí 495 (T-C), vị trí 498 (G-A), vị trí 516 (C-T), vị trí 519 (C-G), vị trí 531 (G-A), vị trí 554 (C-T), vị trí 565 (T-A), vị trí 599 (T-C), vị trí 600 (C-T).
So sánh mức độ sai khác về nucleotide của gene ORF5 giữa hai chủng virus nghiên cứu với nhau và với chủng của Trung Quốc JXA1 và chủng Bắc Mỹ VR2332 thấy hai chủng virus đều có mức độ sai khác với chủng Bắc Mỹ VR2332 cao hơn mức độ sai khác với chủng JXA1.
4.2.3.3. Kết quả so sánh trình tự amino acid của các chủng virus nghiên cứu Từ kết quả so sánh trình tự nucleotide, tiến hành so sánh trình tự amino acid được mã hóa tương ứng từ gene ORF7 và gene ORF5 giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu. Kết quả được minh họa ở hình 4.14, 4.15 và ở các bảng 4.8, 4.9.
Hình 4.14. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF7 của 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu
Hình 4.15. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF5 của 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu
Những sai khác về trình tự nucleotide của bộ ba mã hóa có thể dẫn đến những sai khác về thành phần amino acid (cứ 3 nucleotide của bộ ba mã hóa có thể cho một amino acid- 3 nucleotide này được gọi là bộ 3 mã hóa) tuy nhiên có những sự thay đổi về nucleotide mà không dẫn đến sự thay đổi về amino acid do một số amino acid có thể do nhiều bộ ba nucleotide cùng mã hóa. Chính vì vậy đôi khi sự sai khác về nucleotide lại không dẫn đến sự sai khác về amino acid nên không làm thay đổi cấu trúc của protein được mã hóa bởi gene. Tuy nhiên có những sai khác về nucleotide sẽ dẫn đến những sai khác trong bộ 3 mã hóa và hệ quả là sự sai khác amino acid và có thể thay đổi cả tính chất của protein được tạo ra bởi amino acid này và đây là nguyên nhân phát sinh các biến dị di truyền thay đổi tính gây bệnh của virus. Vậy nên, sau khi xác định được trình tự nucleotide cần xác định tiếp thành phần amino acid của đoạn gene đó để có kết quả chính xác về sự biến đổi ở mức độ phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02.
Bảng 4.8. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus tham chiếu
TT Vị trí Sai khác TT Vị trí Sai khác
1 11 K – R 4 91 A – T
2 15 N – D 5 109 Q – H
3 46 R – K 6 117 A - V
Chúng tôi nhận thấy giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng