thấy, các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam có mức độ tương đồng cao với các chủng của Trung Quốc (Metwally, 2010). Nghiên cứu trên trình tự của đoạn gene ORF7 và ORF5 của 02 chủng virus nghiên cứu cũng cho thấy sự sai khác về nucleotide dẫn đến sự thay đổi amino acid mã hóa trên protein N và protein GP5. Đây là protein đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhiễm của virus PRRS vào tế bào kí chủ và có chứa một số epitop quan trọng trong việc tạo đáp ứng miễn dịch của lợn (Gonin et al.,1999).
4.2.6. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử của các chủng virus nghiên cứu nghiên cứu
4.2.6.1. Kết quả xây dựng cây phả hệ gene ORF5
Từ trình tự gene ORF5 của 02 chủng virus PRRS nghiên cứu, chúng tôi xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của các chủng nghiên cứu với nhau và với một số chủng virus PRRS tham chiếu. Các chủng này có đặc điểm di truyền đại diện cho các chủng lưu hành ở Việt Nam. Kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh của các chủng PRRS nghiên cứu dựa trên sự sai khác nucleotide và amino acid ở đoạn gene ORF5 được thể hiện lần lượt tại hình 4.16.
Từ kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài theo sự sai khác nucleotide gene ORF5 ở hình 4.16 cho thấy: 2 chủng virus KTY-PRRS-01và KTY-PRRS- 02 mà chúng tôi nghiên cứu nằm trong cùng một nhánh phát sinh. Trong đó chủng KTY-PRRS-01 nằm trong nhánh phát sinh với các chủng JF748717/China/2009/YD; chủng KTY-PRRS-02 nằm trong nhánh phát sinh với các chủng JQ860371/Vietnam/2008/DN153.
JQ860362/Vietnam/2008/DN444 JQ860368/Vietnam/2009/DN44 JQ860388/Vietnam/2012/DT8 AB588636/Vietnam/2010/347-T-KS JQ860382/Vietnam/2012/CT.C1 JQ860386/Vietnam/2012/CT.HS3 JN157760/China/2011/JilinTN1 JF748718/China/2010/DC EU880436/China/2008/XL2008 KTY PRRS 02 JQ860371/Vietnam/2008/DN153 EF112445/China/2006/JXA1 KTY PRRS 01 JF748717/China/2009/YD FJ536165/China/2004/NB/04 EU148495/China/2007/Yizheng/06 AY032626/China/1995/CH-1a Sublineage 8.7 EF532801/USA/2004/INGELVAC ATP AF176441/USA/1999/PRRSV19 Sublineage 8.9 Sublineage 8.5 AY656993/USA/2005/SDSU73 Sublineage 8.1 AF176476/USA/2000/PRRSV55 Sublineage 8.3 AF339494/USA/2001/98-31701-1 Lineage 8 AF176462/USA/1999/PRRSV40 AF176466/USA/1999/PRRSV44 Lineage 9 Lineage 9 EU556160/USA/2008/2000-5424 GU187014/Singapore/2009/BCL-PS 100 DQ478179/USA/2006/PRRSV0004283 U87392/USA/1990/ATCC VR-2332 Lineage 5 U66380/USA/1996/34075-NE EU758777/USA/2008/PRRSV0000008765 EU759139/USA/2008/PRRSV0000009234 Lineage 6 Lineage 7 DQ779791/USA/1998/Prime-Pac AF121131/Taiw an/1997/MD-001 EU273667/Taiw an/2007/TY1 EU273687/Taiw an/2007/NT8 Lineage 3 AB546105/Japan/2008/Miyagi08-2 AB175720/Japan/2004/EDRD-8 AB175721/Japan/2004/Gu922M Lineage 4 EU758940/USA/2007/PRRSV0000008973 DQ475573/USA/2006/PRRSV0001028 EU757121/USA/2008/PRRSV0000006493 Lineage 2 Lineage 1 AY297118/Thailand/2002/02SP3 EU757423/USA/2008/PRRSV0000006843 DQ475450/USA/2006/PRRSV0000874 PRRS type 1 M96262/Netherlands/1991/Lelystad virus 95 94 97 94 84 99 77 77 3 47 6 41 73 13 24 11 24 19 29 11 9 26 24 54 85 91 97 90 42 9958 45 69 60 57 0.2
Hình 4.16. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu
Hai chủng virus KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 nằm trong nhánh phát sinh có chủng virus vắc-xin EF112445/China/2006/JXA1 và các chủng độc lực cao được phân lập tại Trung Quốc: năm 2008, 2009, 2010, 2011, 2014, các chủng virus phân lập tại Việt Nam từ năm 2008 – năm 2012 thuộc sublineage 8.7 và
thuộc lineage 8. Hai chủng virus KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 nằm khác với các line từ thuộc PRRS type 2 (Bắc Mỹ), khác với nhánh phát sinh của chủng PRRS type 1 (Châu Âu).
Kết quả khi phân tích về cây phả hệ của 6 chủng virus PRRS được phân lập từ năm 2011-2013 tại miền Bắc Việt Nam của tác giả Đỗ Hải Quỳnh và cs. (2016) cũng cho thấy các chủng virus này đều thuộc dòng (type) Bắc Mỹ, nhánh (sub-lineage) 8.7. Như vậy có thể thấy, kết quả nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 là tương tự với các chủng virus PRRS đã được nghiên cứu bởi những tác giả trên.
4.2.6.2. Kết quả xây dựng cây phả hệ gene ORF7
Trong phân tích mối quan hệ di truyền cũng như dịch tễ học phân tử của virus PRRS ngoài phân tích các trình tự của gene ORF5, các nghiên cứu trên thế giới cũng phân tích cả trình tự gene ORF7 đây là protein màng sản sinh kháng thể trung hòa lớn của virus PRRS. Nghiên cứu sinh học phân tử của ORF7 không chỉ phục vụ mục đích chẩn đoán mà còn góp phần tìm hiểu đặc tính phân tử của virus PRRS. Chính vì vậy dựa trên trình tự gene ORF7, chúng tôi đã xây dựng cây sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Kết quả dựng cây sinh học phân tử được thể hiện ở hình 4.17.
Từ kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài theo sự sai khác nucleotide gene ORF7 ở hình 4.17 cho thấy:
2 chủng virus KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 nghiên cứu nằm trong 1 nhánh phát sinh.
Trong đó chủng KTY-PRRS-01 nằm trong nhánh phát sinh với các chủng phân lập tại Việt Nam từ năm 2008 – 2012 là các chủng
JQ860392/Vietnam/2008/DN444, JQ860400/Vietnam/2009/DN59,
JQ860414/Vietnam/2012/CT.C1; chủng KTY-PRRS-02 nằm trong nhánh phát sinh với chủng vắc-xin Trung Quốc EF112445/China/2006/JXA1; chủng Trung Quốc độc lực cao JF268680/China/2009/09 HEN2 và chủng JF268682/China/2009/09 HUB1 và một số chủng được phân lập tại Việt Nam năm 2008 JQ860395/Vietnam/2008/DN460 và JQ860403/Vietnam/2008/DN153.
Hai chủng KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 nằm trong nhánh phát sinh có chủng vắc-xin JXA1.
JQ860407/Vietnam/2009/DN1155 JQ860409/Vietnam/2010/DN5.2 JQ860405/Vietnam/2009/DN339 JQ860402/Vietnam/2009/DN88 JQ860400/Vietnam/2009/DN59 JQ860392/Vietnam/2008/DN444 JQ860397/Vietnam/2008/DN694 JQ860419/Vietnam/2012/DT7 KTY-PRRS-01 JQ860414/Vietnam/2012/CT.C1 JQ860415/Vietnam/2012/CT.C2 JQ860417/Vietnam/2012/CT.HS2 JF268680/china/2009/09HEN2 JF268682/china/2009/09HUB1 EF112445/China/2006/JXA1 KTY-PRRS-02 JQ860395/Vietnam/2008/DN460 JQ860403/Vietnam/2008/DN153 GU232735/china/2008/KP KM659201/Vietnam/2012/DB2012-2DB KM659202/Vietnam/2012/DB2012-9DB Lineage 1 D45852/Japan/1995/EDRD-1 AY209222/USA/2003/27E Lineage 2 AF066183/USA/2005/RespPRRS vaccine U87392/USA/1990/ATCC VR-2332 EF441853/Korea/2006/06K805 EF441809/Korea/2006/05K205 Lineage 3 AY032626/China/1996/CH-1a EU262603/china/2007/EM2007 PRRS type 1 M96262/Holand/1991/Lelystad 42 57 76 33 39 99 99 91 58 39 35 48 65 46 78 0.1
Hình 4.17. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu
Hai chủng KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 nằm trong line 1 khác line 3 thuộc PRRS type 2 (Bắc Mỹ), khác với nhánh phát sinh của chủng PRRS type 1 (châu Âu)
Kết luận: Hai chủng này cùng nhánh với chủng độc lực cao của Trung Quốc và thuộc PRRS type 2 (Bắc Mỹ). Điều này chứng tỏ có sự lây truyền bệnh qua biên giới giữa các quốc gia trên thế giới.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN
1) Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học của 02 chủng virus KTY- PRRS-01 và virus KTY-PRRS-02:
- 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều thích nghi tốt và gây bệnh tích tế bào trên môi trường tế bào Marc 145.
- Biến đổi bệnh tích tế bào bắt đầu quan sát thấy sau 36 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01và chủng KTY-PRRS-02. CPE đạt 100% tại 84 giờ và bong tróc hoàn toàn tại 96 giờ sau khi gây nhiễm chủng virus KTY-PRRS-01. CPE đạt 85% tại 60 giờ và 100% tại 72 giờ sau khi gây nhiễm chủng virus KTY- PRRS-02. Cả 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus PRRS vắc-xin có quy luật nhân lên trong môi trường tế bào là giống nhau. Virus giải phóng ra ngoài tế bào có hiệu giá cao hơn virus ở trong tế bào. Thời điểm hiệu giá virus đạt cao nhất được xác định trong khoảng 60 giờ đến 84 giờ sau gây nhiễm.
- Cả 2 chủng virus PRRS nghiên cứu đều có khả năng gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm
2)Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 2 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02:
- Mức độ tương đồng nucleotide ở gene ORF7 và ORF5 giữa 2 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ khá cao lần lượt là 98,58% và 98,03%
- Mức độ tương đồng về nucleotide ở gene ORF7 và gene ORF5 giữa 2 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ lần lượt là 92,93%- 99,65% và 85,12%-99,42%.
- Mức độ tương đồng về amino acid tương ứng ở gene ORF7 và gene ORF5 giữa 02 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ khá cao lần lượt là 96,32% và 95,04%.
- Mức độ tương đồng về amino acid tương ứng ở gene ORF7 và gene ORF5 giữa 2 chủng PRRS nghiên cứu với các chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ dao động lần lượt là 82,88%-98,80% và 84,36%-98,80%. Điều này cho thấy sự tương đồng giữa kết quả so sánh mức độ tương đồng giữa trình tự nucleotide và trình tự amino acid.
- Hai chủng virus KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 có cùng nhánh phát sinh với chủng độc lực cao của Trung Quốc và thuộc PRRS type 2 (Bắc Mỹ).
5.2. KIẾN NGHỊ
Tiếp tục tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về sự ổn định đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 để có thể lựa chọn được chủng tiềm năng phục vụ cho việc như: chọn chủng giống gốc để sản xuất vắc-xin PRRS, đánh giá hiệu lực của các loại vắc-xin, hoặc các chế phẩm sinh học như kít chẩn đoán nhanh, kháng nguyên dùng trong chẩn đoán,… nhằm phòng, trị PRRS.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt:
1. Cục Thú y (2008). Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome). Báo cáo tại Hội thảo khoa học phòng chống hội chứng Rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn, ngày 21/5/2008, Hà Nội.
2. Đỗ Hải Quỳnh, Vũ Thị Thu Hằng, Thân Đức Dương, Nguyễn Bá Hiên và Lê Văn
Phan (2016). Đa dạng di truyền gen ORF5 của một số chủng virus PRRS phân lập từ năm 2011 đến năm 2013 tại miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y. Tập XXIII. (1). tr. 29-38.
3. Đỗ Tiến Duy và Nguyễn Tất Toàn. (2016). So sánh tương đồng gen giữa các chủng
PRRSV độc lực cao thu thập thực đại với các chủng vacxin thương mại. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XXIII . (3). tr. 15-25.
4. Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007). Một số hiểu biết về virus gây hội
chứng rối loạn hô hấp và sinh sản của lợn. Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản và bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, ngày 11/10/2007, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
5. Nguyễn Bá Hiên, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Hữu Nam, Trịnh Đình Thâu, Phạm
Hồng Ngân, Phạm Ngọc Thạch, Lê Huỳnh Thanh Phương, Chu Đức Thắng, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và Nguyễn Bá Tiếp (2015). Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. Đề tài cấp Nhà nước.
6. Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan (2007). Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh
sản. Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản và bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, ngày 11/10/2007, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
7. Nguyễn Ngọc Tiến (2011). Báo cáo tình hình dịch bệnh tai xanh (PRRS) ở Việt
Nam và công tác phòng chống dịch. Truy cập ngày 2/5/2016 tại http://text.123doc.org/document/1237638-bao-cao-tinh-hinh-dich-lon-tai-xanh-prrs- o-viet-nam-va-cong-tac-phong-chong-dich-pot.htm.
8. Nguyễn Thị Lan và Lương Quốc Hưng (2012). Nghiên cứu một số đặc tính sinh
học của vi rút gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS) phân lập được trên đàn lợn nuôi tại một số tỉnh phía Bắc, Việt Nam. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, kỳ 2, tháng 7/2012. tr. 82-87.
9. Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Bá Hiên, Trịnh Đình Thâu, Cao Thị Bích Phượng và Lê
Văn Hùng (2016). So sánh một số đặc tính sinh học của chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam (KTY-PRRS-04) qua các đời cấy truyền. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XXIII. (6). tr. 5-13.
10. Nguyễn Thị Thu Hằng, Lê Quang Hòa, Trần Thị Thanh Hà, Trần Thị Thu Hằng và Nguyễn Viết Không (2016). Một số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) phân lập được tại Việt Nam từ các ổ dịch năm 2007, 2010, 2013. Tạp chí Khoa học và kỹ thuật Thú y, tập XXIII (3). tr. 26-34.
11. Tiêu Quang An (2012). Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lí của lợn mắc hội chứng
rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS), sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để phát hiện virus. Luận án Tiến sỹ, Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
12. Trịnh Đình Thâu, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Nguyễn
Hữu Nam, Lê Huỳnh Thanh Phương, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Văn Thọ, Phạm Ngọc Thạch và Phạm Hồng Ngân (2016). Nghiên cứu tạo giống gốc để sản xuất vắc-xin phòng hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản cho lợn (PRRS) ở Việt Nam. Đề tài cấp Nhà nước.
Tiếng Anh:
13. Benson J. E., M. J. Yaeger, J. Christopher-Hennings, K. Lager and K.-J. Yoon
(2002). A comparison of virus isolation, immunohistochemistry, fetal serology, and reverse-transcription polymerase chain reaction assay for the identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus transplacental infection in the fetus. Journal of veterinary diagnostic investigation. Vol 14 (1). pp. 8-14.
14. Chia M.-Y., S.-H. Hsiao, H.-T. Chan, Y.-Y. Do, P.-L. Huang, H.-W. Chang, Y.-C.
Tsai, C.-M. Lin, V. F. Pang and C.-R. Jeng (2010). Immunogenicity of recombinant GP5 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressed in tobacco plant. Veterinary immunology and immunopathology. Vol 135 (3). pp. 234-242.
15. Chiou M.-T., C.-R. Jeng, L.-L. Chueh, C.-H. Cheng and V. F. Pang (2000). Effects
of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (isolate tw91) on porcine alveolar macrophages in vitro. Veterinary microbiology. Vol 71 (1). pp. 9-25.
16. Collins J. E., D. A. Benfield, W. T. Christianson, L. Harris, J. C. Hennings, D. P.
Shaw, S. M. Goyal, S. McCullough, R. B. Morrison and H. S. Joo (1992). Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. Vol 4 (2). pp. 117-126.
17. De Abin M. F., G. Spronk, M. Wagner, M. Fitzsimmons, J. E. Abrahante and M. P.
Murtaugh (2009). Comparative infection efficiency of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates on MA104 cells and porcine alveolar
macrophages. Canadian Journal of Veterinary Research. Vol 73 (3). pp. 200-204.
18. Fang L., Y. Jiang, S. Xiao, C. Niu, H. Zhang and H. Chen (2006). Enhanced
immunogenicity of the modified GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Virus Genes. Vol 32 (1). pp. 5-11.
19. Feng Y., T. Zhao, T. Nguyen, K. Inui, Y. Ma, T. H. Nguyen, V. C. Nguyen, D. Liu,
Q. A. Bui and L. T. To (2008). Porcine respiratory and reproductive syndrome virus variants, Vietnam and China, 2007. Emerg Infect Dis. Vol 14 (11). pp. 1774- 6.
20. Grebennikova T.V., Syroeshkin A.V, Musienko M.I, Zaberezhny A.D., Aliper T.I.
(2005). Changes of microelement content in Marc-145 cells before and after infection with virulent and attenuated strains of PRRS virus. 2005 International PRRS Symposium. Westport Conference Center, St. Louis, Missouri December 2- 3, 2005.
21. Han J., G. Liu, Y. Wang and K. S. Faaberg (2007). Identification of nonessential
regions of the nsp2 replicase protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain VR-2332 for replication in cell culture. Journal of virology. Vol 81 (18). pp. 9878-9890.
22. Han, J., M.S. Rutherford, and K.S. Faaberg (2010). Proteolytic products of the
porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp2 replicase protein. Journal
of virology, 2010. 84(19): p. 10102-10112.
23. Harel S., M. A. Salan and J. Kanner (1988). Iron release from metmyoglobin,
methaemoglobin and cytochrome c by a system generating hydrogen peroxide. Free radical research communications. Vol 5 (1). pp. 11-19.
24. Jaffe, E.R (1981). Methaemoglobinaemia. Clin. Haematol. 10: 99-122
25. Keffaber K. (1989). Reproductive failure of unknown etiol-ogy. Am. Assoc. Swine
Pract. Newsl. Vol 1. pp. 1-9.
26. Keirstead N. D., C. Lee, D. Yoo, A. S. Brooks and M. A. Hayes (2008). Porcine
plasma ficolin binds and reduces infectivity of porcine reproductive and respiratory