Tại thời điểm từ 36 giờ - 48 giờ sau khi gây nhiễm, lượng virus giải phóng tự do của chủng virus KTY-PRRS-01 tăng với giá trị log TCID50 tăng từ 3,5 tới 4,5. Lượng virus giải phóng tự do của chủng virus KTY-PRRS-02 tăng với giá trị log TCID50 tăng từ 3,5 tới 4,83. CPE tại thời điểm 48giờ sau gây nhiễm tăng so với thời điểm 36 giờ sau gây nhiễm, đây là thời điểm chủng virus nghiên cứu này phát triển yếu trong tế bào, hàm lượng virus tự do tăng do lượng tế bào bị virus phá vỡ tăng mạnh, virus được giải phóng ra môi trường nuôi cấy. Nhưng cũng trong thời gian này thì virus vắc-xin tăng cường xâm nhập vào tế bào và nhân lên trong tế bào dẫn đến hàm lượng virus trong tế bào tăng.
Thời điểm 72 giờ – 84 giờ sau khi gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02 và 60giờ sau khi gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01, tế bào bị phá hủy gần như hoàn toàn thì lượng virus giải phóng ra bên ngoài tế bào tăng lên và đạt mức cao ở 60 giờ-84 giờ sau khi gây nhiễm, điều này tương ứng với hàm lượng virus trong tế bào giảm dần và đạt mức thấp tại 96 giờ sau khi gây nhiễm, vì lúc này tế bào đã bị phá hủy và bong tróc hoàn toàn. Đối với chủng virus vắc-xin, thời gian từ 48 giờ đến 72 giờ sau gây nhiễm, virus tăng cường giải phóng khỏi tế bào, quá trình xâm nhập và nhân lên trong tế bào của virus diễn ra chậm.
Cả chủng virus vắc-xin và 02 chủng virus nghiên cứu đều thể hiện rằng chúng xâm nhập và nhân lên trong tế bào mạnh hay yếu tùy từng thời điểm nhất định. Như vậy, sự nhân lên của virus khi nuôi cấy trên môi trường tế bào không phải là một quá trình liên tục và đồng đều. Trong đó, những thời điểm phát triển mạnh trong tế bào hay ngoài tế bào của các chủng virus không giống nhau hoàn toàn trong toàn bộ thời gian sau khi đem gây nhiễm virus trên môi trường tế bào Marc 145. Kết quả của luận văn phù hợp với kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và Lương Quốc Hưng (2012) và Nguyễn Bá Hiên và cs. (2015). Kết quả này cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và cs. (2016) khi nghiên cứu về một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-04 qua các đời cấy truyền.
Qua nghiên cứu một số đặc tính sinh học của 02 chủng virus KTY-PRRS- 01 và KTY-PRRS-02 thấy rằng cả 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus PRRS vắc-xin đều có khả năng gây bệnh tích tế bào trên môi trường Marc 145, có quy luật nhân lên trong môi trường tế bào là giống nhau. Virus giải phóng ra ngoài tế bào có hiệu giá cao hơn virus ở trong tế bào. Thời điểm hiệu giá virus đạt cao nhất được xác định trong khoảng 60 giờ đến 84 giờ sau gây
nhiễm. Điều này rất có ý nghĩa trong việc xác định thời gian và phương pháp để thu hoạch được lượng virus là cao nhất.
4.1.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus KTY – PRRS-01 và KTY-PRRS-02 virus KTY – PRRS-01 và KTY-PRRS-02
4.1.4.1. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus PRRS
Từ 2 chủng virus KTY–PRRS–01, KTY-PRRS-02 được lựa chọn và được nhân lên trên môi trường tế bào Marc 145 với số lượng lớn, chúng tôi đã tiến hành tinh chế kháng nguyên virus bằng máy siêu ly tâm của hãng Beckman Counter và gradient đường Sucrose. Kết quả đã thu được kháng nguyên tinh khiết của 2 chủng virus khác nhau.
Việc tinh chế kháng nguyên virus có ý nghĩa quan trọng đối với việc chế tạo kháng thể vì kháng nguyên càng tinh khiết bao nhiêu thì kháng thể tạo ra càng đặc hiệu bấy nhiêu. Các chủng virus mà chúng tôi phân lập được nhân lên trong môi trường tế bào, chính vì vậy không tránh khỏi các thành phần của tế bào khi thu virus. Nếu các thành phần tế bào đó được đưa vào cơ thể sống thì nó cũng như một kháng nguyên sẽ kích thích cơ thể sản sinh kháng thể tương ứng chống lại các thành phần này và sẽ không tạo ra được hàm lượng lớn kháng thể đặc hiệu như chúng ta mong muốn. Đồng thời việc sử dụng gradient đường kết hợp ly tâm tốc độ cao cho phép tách các thành phần có độ lớn khác nhau và cho phép thu được protein kháng nguyên của virus PRRS. Tạo được protein kháng nguyên tinh khiết sẽ là cơ sở cho bước gây miễn dịch để chế kháng thể có độ đặc hiệu cao. Để kiểm tra kết quả tinh chế protein kháng nguyên, mỗi lần tinh chế chúng tôi đều kiểm tra hàm lượng protein sau khi tinh chế, chúng tôi tiến hành định lượng protein kháng nguyên thu được bằng assay protein (BCA KIT) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ protein kháng nguyên được thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus PRRS Kháng nguyên virus chế từ chủng virus Nồng độ KN lần 1 (mg/ml) Nồng độ KN lần 2 (mg/ml) Nồng độ KN lần 3 (mg/ml) KTY – PRRS - 01 1 1 1 KTY – PRRS – 02 1 1 1,2
Các kháng nguyên tinh chế được có hàm lượng tương đối cao và ổn định qua các lần thí nghiệm khác nhau. Kháng nguyên sau khi tinh chế được sử dụng cho việc thử nghiệm sự tạo miễn dịch trên chuột lang để kiểm tra tính đáp ứng miễn dịch của các chủng virus PRRS.
4.1.4.2. Kết quả gây tối miễn dịch cho chuột lang và thỏ bằng kháng nguyên PRRSV tinh chế
Lấy máu chuột và thỏ chắt huyết thanh kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV bằng phản ứng IPMA vào thời điểm 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên lần 1. Kết quả cho thấy tất cả các chuột và thỏ ở 4 lô thí nghiệm đều có kháng thể kháng PRRSV còn lô chuột đối chứng và thỏ đối chứng không có kháng thể kháng virus PRRS trong huyết thanh. Tiếp tục tiêm kháng nguyên lần 2 cho các lô chuột và thỏ, tiến hành theo dõi và kiểm tra kháng thể kháng PRRSV ở 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên lần 2. Kết quả cũng cho thấy rằng tất cả các chuột và thỏ đều có chứa kháng thể kháng PRRSV đạt tỷ lệ khá cao như bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả của phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV ở thời điểm 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên PRRS lần 2
Stt Động vật TN Lô thí nghiệm Kết quả kháng thể dương tính
Tỷ lệ
(%) Kết luận
1
Chuột lang
Lô CL1 (n=10) 10/10 100 Đạt yêu cầu
2 Lô CL2 (n=10) 10/10 100 Đạt yêu cầu
3 Lô CLĐC (n=5) 0/5 0 Đạt yêu cầu
4
Thỏ
Lô T1 (n=8) 8/8 100 Đạt yêu cầu
5 Lô T2 (n=8) 8/8 100 Đạt yêu cầu
6 Lô TĐC (n=4) 0/4 0 Đạt yêu cầu
Theo quy luật hình thành kháng thể dịch thể đặc hiệu, khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng (thời gian này ngắn hay dài phụ thuộc vào loại kháng nguyên, lần xâm nhập của kháng nguyên lần đầu hay lần 2). Sau đó kháng thể mới được sinh ra, lượng kháng thể tăng dần đạt cao nhất sau 2 đến 3 tuần rồi giảm dần và biến mất sau vài tháng hoặc vài năm. Khi đưa kháng nguyên vào lần 2 thời gian tiềm tàng ngắn hơn, lượng kháng thể sản xuất ra nhiều hơn. Sự khác biệt này là do vai trò của tế bào nhớ miễn dịch Lympho T “nhớ” và Lympho B “nhớ”, ở miễn dịch thứ phát các tế bào nhớ miễn dịch phát triển nhanh, mạnh tạo ra một lớp tế bào sản xuất kháng thể đặc hiệu đây là cơ sở khoa học cho việc tiêm 2 lần kháng nguyên và thu kháng thể vào 2 tuần sau khi mũi tiêm cuối cùng kết thúc. Lúc này lấy máu của tất cả các chuột và thỏ thí nghiệm sẽ cho hàm lượng kháng thể cao.
Sau 2 lần tiêm kháng nguyên PRRS đã tinh chế, kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV ở tất cả các lô chuột lang và thỏ đều đạt yêu cầu, chúng tôi tiến hành mổ chuột lang và thỏ, thu huyết thanh của tất cả các lô chuột lang và thỏ thí nghiệm. Các mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng PRRSV của tất cả các lô thí nghiệm được bảo quản ở 40C hoặc -200C để dùng cho việc đánh giá hiệu giá kháng thể.
Chúng tôi đã dùng phản ứng IPMA để đánh giá hiệu giá kháng thể sau khi tinh chế, dùng kháng nguyên chuẩn là kháng nguyên PRRSV tinh chế với độ pha loãng 10-2. Kháng thể được pha loãng 1/40, 1/160, 1/640, 1/2560. Mỗi mẫu được lặp lại thí nghiệm trên 5 giếng. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của chuột và thỏ thí nghiệm sau 2 lần tiêm kháng nguyên Hiệu giá pha
loãng kháng thể Tỷ lệ dương tính với kháng thể kháng PRRSV (%) Lô chuột 1 Lô chuột 2 Lô chuột đối chứng Lô thỏ 1 Lô thỏ 2 Lô thỏ ĐC 1/40 100 100 0 100 100 0 1/160 100 100 0 100 100 0 1/640 80 70 0 87,5 75 0 1/2560 20 30 0 37,5 37,5 0 1/10240 0 0 0 0 0 0
Kết quả cho thấy cả 4 lô thí nghiệm chuột và thỏ được gây nhiễm 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều có kháng thể kháng virus PRRS và ở mức tương đối cao. Như vậy, 02 chủng virus nghiên cứu KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều có tính kháng nguyên, có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cho động vật thí nghiệm.