PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS
2.2.2. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS
2.2.2.1. Tính chất nuôi cấy của virus PRRS
Có nhiều dòng tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy virus. Tuy nhiên virus PRRS chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang lợn (Porcine Alveolar Macrophage) và tế bào thận khỉ (Marc 145, CL2621).
PAM là môi trường tốt nhất cho phân lập virus vì nó có độ nhạy cao nhất, virus có thể nhân lên với số lượng lớn và có thể nuôi cấy tất cả các chủng virus PRRS trên thế giới. Nhưng nhược điểm của nó là phải chuẩn bị môi trường từ những con lợn khỏe mạnh và PAM không phải là tế bào dòng nên sự nhân lên của tế bào là có giới hạn do đó không thể lưu giữ virus trong thời gian lâu dài (Kim et al., 1993).
Theo Yoon and Stevenson (1999) thì không phải tất cả virus PRRS đều phát triển ở cả hai loại tế bào này mà PAM nhạy cảm với virus hơn so với CL2621, đặc biệt khi mẫu được dùng là huyết thanh. Một số tác giả cho rằng PRRSV chủng Châu Mỹ phát triển tốt hơn trên Marc 145, ngược lại PRRSV chủng Châu Âu lại phát triển nhanh hơn trên PAM. Theo những nghiên cứu về dịch tễ học phân tử thì virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam có độ tương đồng cao với virus PRRS chủng châu Mỹ hơn là với virus PRRS chủng châu Âu. Vì thế dòng tế bào Marc 145 đã từng được lựa chọn trong hầu hết những nghiên cứu về PRRSV tại Việt Nam.
Năm 2010, sau khi có kết quả so sánh về sự tương đồng giữa chủng virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam và chủng PRRS tại Trung Quốc, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã quyết định nhập khẩu vacxin phòng PRRS từ Trung Quốc. Đây là loại vacxin nhược độc đông khô chủng JXA1-R sản xuất từ chủng virus độc lực cao. Vacxin JXA1-R cũng là dòng vacxin được nhược độc hóa qua nhiều lần tiếp truyền trên tế bào Marc 145. Lúc đầu chủng virus JXA1 là chủng virus cường độc, sau 82 đời tiếp truyền trên tế bào Marc 145, chủng virus này trở nên nhược độc và được sử dụng để sản xuất vacxin. Chỉ số TCID50 của chủng virus này ổn định ở mức độ TCID50/ml ≥ 104 (Yu et al., 2015).
Một chủng virus PRRS cường độc khác phân lập tại Trung Quốc cũng được sử dụng trong nghiên cứu là chủng TJ. Chủng virus PRRS này sau khi tiếp truyền qua 92 đời tế bào Marc 145 đã đạt tiêu chuẩn trở thành chủng nhược độc và được thử nghiệm cho công việc sản xuất vắc-xin (Leng et al., 2012).
Những nghiên cứu sâu hơn cho thấy có sự liên quan giữa những đột biến về genome của virus PRRS với sự thay đổi về nồng độ của những nguyên tố vi lượng trong môi trường nuôi cấy tế bào (Ni, Mn và Fe) (Grebennikova et al., 2005).
2.2.2.2. Một số nghiên cứu về khả năng nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào Marc145 thông qua khả năng gây bệnh tích tế bào
Nghiên cứu của De Abin et al. (2009) đã sử dụng 2 dòng tế bào là đại thực bào phế nang (PAM) và MA104 để phân lập virus PRRS từ các mẫu thu thập được. Dòng tế bào MA104 có nguồn gốc từ thận khỉ xanh Châu Phi. Tế bào MA104 được nuôi cấy trên môi trường MEM có bổ sung 2 mM L-glutamine, và muối đệm cơ bản Earle có chứa 1,5g/L NaHCO3, 0,1 mM amino acid không thiết yếu, 1mM dung dịch CH3COCOONa và 10% FBS. Hai dòng tế bào đại thực bào phế nang (PAM) và MA104 được nuôi cấy trên khay 24 giếng với số lượng tế bào trên mỗi giếng tương ứng là 2 x 106 và 2 x 105 tế bào. Các giếng tế bào được gây nhiễm với 300 µl dung dịch mẫu huyết thanh kiểm tra với tỷ lệ gây nhiễm (M.O.I) là 2. Sau một giờ ủ ở nhiệt độ phòng, bổ sung thêm môi trường nuôi cấy và nuôi ở 370C trong tủ ấm có bổ sung CO2. Dịch nổi và tế bào được thu thập khi quan sát thấy bệnh tích tế bào (CPE) chiếm khoảng 70% hoặc nhiều hơn sau 6 ngày gây nhiễm hoặc nếu không quan sát thấy bệnh tích. Các virus phân lập được kiểm tra lại bằng phương pháp RT-PCR và miễn dịch huỳnh quang (IF) theo Valicek et al. (1997).
Nghiên cứu của Fang et al. (2006) đã chọn chủng virus PRRS là YA được phân lập từ phổi lợn mắc triệu chứng cấp tính với PRRS tại một tỉnh của Trung Quốc và được xác định là thuộc serotype Bắc Mỹ độc lực cao. Chủng virus này được nuôi cấy trên môi trường tế bào Marc 145, là một dòng tế bào có nguồn gốc từ dòng tế bào MA104 thích ứng tốt cho việc nhân lên của virus. Tế bào Hela được sử dụng để gây nhiễm. Cả tế bào Marc 145 và tế bào Hela được nuôi trong môi trường DMEM, GIBCO có bổ sung 10% FBS, 100 µg.ml streptomycin và 100 IU/ml penicillin, được nuôi cấy ở điều kiện 370C và 5% CO2.
Nghiên cứu của Benson et al. (2002) đã thực hiện phân lập virus trên môi trường tế bào Marc 145 có bổ sung vào môi trường nuôi cấy EMEM 10% FCS và gentamycin sulfate (0,05 mg/ml). 200 µl của mẫu được bổ sung thêm 1ml môi trường dinh dưỡng được ủ với môi trường tế bào Marc 145 mọc một lớp ở điều kiện 370C và 5% CO2. Môi trường nuôi cấy tế bào được kiểm tra hàng ngày sau 7 ngày gây nhiễm để phát hiện bệnh tích tế bào. Môi trường nuôi cấy (khoảng 0,2ml) được sử dụng để cấy chuyển virus sang đời thứ 2 khi việc phân lập lần 1 không thành công. Ở lô đối chứng âm không quan sát thấy bệnh tích tế bào xuất hiện trên môi trường nuôi cấy.
Nghiên cứu của Keirstead et al. (2008) đã thực hiện nuôi cấy dòng tế bào Marc 145 trên môi trường DMEM có bổ sung 5% FBS, 2mL L-Glutamine, 100 đơn vị/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin. Tế bào được nuôi cấy ở điều kiện 370C và 5% CO2. Chủng virus PA8 (Bắc Mỹ) được nuôi cấy trên môi trường tế bào Marc 145 được gây nhiễm với dung dịch virus với liều 200 TCID50 và ủ ở điều kiện 370C và 5% CO2 trong 72 giờ. Hỗn dịch sau khi gây nhiễm virus được bảo quản ở -700C và được giã đông 3 lần. Kháng nguyên của virus được tinh chế quan đường sucrose gradient nồng độc với ly tâm tốc độ 90 000 g trong 1 giờ. Việc tiến hành gây nhiễm virus được thực hiện bằng các trộn hỗn dịch virus với tế bào, sau đó ủ trong 1 giờ ở 370C với khoảng chừng 2 x 105 tế bào Marc 145 với 100 µl được cho vào mỗi giếng. Sau 3 ngày gây nhiễm, từng giếng sẽ được đánh giá bệnh tích tế bào theo phương pháp của Lee and Yoo (2006).
Nghiên cứu của Kreutz (1998) đã thực hiện xác định sự nhân lên của virus trên các dòng tế bào khác nhau, các tế bào được ủ với virus và cố định sau 20 giờ gây nhiễm để xác định bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA). Các tế bào được cố định được ủ với kháng kháng thể, sau đó là chất gắn huỳnh quang và được quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang.
Trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu Li et al. (2007), nhóm tác giả đã thực hiện dòng tế bào Marc 145 và 293A được nuôi cấy trong môi trường DMEM của Gibco-BRL có bổ sung 10% FCS, 170 mM penicillin và 40 mM streptomycin. Môi trường nuôi cấy được nuôi trong điều kiện tủ ấm có bổ sung 5% CO2 và được ủ ở điều kiện 370C. Sau đó các tế bào được trypsin hóa và chia ra khay 96 giếng với số lượng tế bào trên mỗi giếng đạt khoảng 104 tế bào/giếng (với khay 24 giếng thì số lượng tế bào đạt 105 tế bào/giếng), các tế bào này được chuẩn bị trước 16h trước khi gây nhiễm. Với khay 96 giếng, các tế bào được gây nhiễm với 0,4 µg/giếng plasmid chứa shRNA bằng cách sử dụng bộ kit FAST. Với khay 24 giếng dùng 0,2 µg/giếng pEGFP-N1 cùng với 0,8 µg/giếng plasmid chứa shRNA, tổng là 1 µg/giếng. Sau một giờ gây nhiễm, bổ sung môi trường DMEM có 4% FCS, không đổ bỏ dung dịch sau khi gây nhiễm. Sau 24 giờ, các tế bào được gây nhiễm với 10 lần MOI và quan sát bệnh tích tế bào.
Nghiên cứu của Tsai et al. (2012) đã tiến hành gây nhiễm chủng virus tw91 được phân lập tại Đài Loan và dã được cấy chuyển 8 đời với hiệu giá virus đạt 107 TCID50/ml. Chủng virus này được nuôi cấy trên môi trường tế bào Marc 145 và được quan sát theo dõi bệnh tích tế bào theo phương pháp của nghiên cứu Chiou et al. (2000).
2.2.2.3. Một số nghiên cứu về quy luật nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào
Nghiên cứu của Fang et al. (2006) đã thực hiện nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của virus trong điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào Marc 145. Virus được tiến hành gây nhiễm trên môi trường Marc 145 với giá trị MOI = 0,1. Sau khi gây nhiễm virus với tế bào, tế bào được thu tại các thời điểm 0, 6, 12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ sau khi gây nhiễm, hiệu giá virus được xác định bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên môi trường tế bào Marc 145 và xác định số lượng bằng phương pháp huỳnh quang (FFU/ml).
Nghiên cứu của Han et al. (2007) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của virus trên dòng tế bào MA 104 trên môi trường nuôi cấy tế bào bằng bình T25 với giá trị MOI là 5 x 104 PFU. Sau một giờ ủ ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ, hỗn dịch ủ được loại bỏ khỏi môi trưởng nuôi cấy, sau đó được rửa 3 lần bằng môi trường EMEM. Sau khi rửa, 7ml môi trường được thêm vào các bình và được ủ ở điều kiện 370C với 5% CO2 sau 5 ngày. Các mẫu được lấy từ môi
trường nuôi cấy tạo các thời điểm gây nhiễm khác nhau và hiệu giá bằng cách tính khuẩn lạc. Với chủng virus V7-nsp2324-726 và VR-V7 được gây nhiễm với 103 TCID50. Dịch gây nhiễm virus được lấy 12 giờ và hiệu giá bằng phương pháp pha loãng tới hạn, hiệu giá được xác định dựa trên giá trị TCID50.
Nghiên cứu của Han et al. (2010) đã tiến hành nuôi cấy tế bào Marc 145 trong bình T25, sau đó tiến hành gây nhiễm với giá trị MOI là 0,1 với chủng virus bố mẹ và chủng virus đột biến sau khi cấy chuyển 3 đời. Sau khi ủ một giờ ở nhiệt độ phòng, trộn nhẹ, hỗn dịch gây nhiễm được rửa 3 lần với dung dịch EMEM không có huyết thanh; môi trường sau đó được bổ sung 7ml môi trường nuôi dưỡng. Các mẫu được thu thập từ môi trường tại các thời điểm gây nhiễm khác nhau và được xác định khuẩn virus trên môi trường nuôi cấy Marc 145.
Nghiên cứu của Kwon et al. (2006) đã tiến hành so sánh khả năng nhân lên của virus có nguồn gốc từ chủng PP18 và FL12 với chủng vắc xin PP và chủng virus Neb-1 trên cả môi trường nuôi cấy Marc145 và tế bào đại thực bào (PAM). Số lượng bản sao RNA từ dịch nuôi cấy của những tế bào gây nhiễm virus được xác định bằng phản ứng định lượng Real-time PCR. Để nghiên cứu sự nhân lên của virus, tế bào Marc145 được gây nhiễm với các chủng virus ở trên với giá trị MOI là 10 và được ủ ở nhiệt độ 370C. Tại các thời điểm sau khi gây nhiễm, dịch môi trường nuôi cấy từ các tế bào gây nhiễm được lấy và xác định hiệu giá virus bằng cách xác định giá trị TCID50/ml.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và Lương Quốc Hưng (2012) khi nghiên cứu về đặc tính sinh học của một số chủng virus PRRS phân lập tại miền Bắc, Việt Nam trên tế bào Marc 145 cũng đã đưa ra quy luật nhân lên của virus thông qua đường cong sinh trưởng. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và cs. (2016) khi nghiên cứu về sự ổn định đặc tính sinh học của virus KTY-PRRS 04 qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào, cũng chỉ ra các đường cong sinh trưởng của virus qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc145.
Nguyễn Bá Hiên và cs. (2015) và Trịnh Đình Thâu và cs. (2016) khi tiến hành nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của một số chủng virus PRRS được phân lập từ năm 2013 – 2015 nhằm chọn chủng virus đáp ứng được các yêu cầu để sản xuất vắc-xin phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản cho lợn cũng đã đưa ra các quy luật nhân lên của các chủng virus phân lập được trên môi trường tế bào, thông qua đường cong sinh trưởng của virus.