PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.5. Phương pháp R T– PCR
- Phương pháp tách chiết RNA
Từ các mẫu bệnh phẩm thu thập được của lợn mắc PRRS, các mẫu virus sau nuôi cấy được bảo quản trong điều kiện -800C, tiến hành tách chiết RNA của virus để chẩn đoán lợn mắc bệnh.
- Quy trình tách chiết RNA của virus được thực hiện theo hướng dẫn của bộ KIT của hãng Qiagen.
- Tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau: Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5 Primer Forwad 0,5 Primer Reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6
Tổng thể tích 25
Cặp mồi được sử dụng để khuếch đại hai đoạn gene ORF7 và ORF5:
Gen Mồi Trình tự (5’-3’) Kích thước gen khuếch đại
ORF5 Mồi xuôi ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC
720 bp
Mồi ngược CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC CGC
ORF7 Mồi xuôi GAT TGC GGC AAA TGA TAA CC
372 bp
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cADN 50 30 phút 1 Duỗi mạch 95 5 phút 2 Duỗi mạch 95 15 giây 35 Gắn mồi 50 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Chuẩn bị thạch Agarose 1,2%: Cân 1,2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 ul Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần điện di.
- Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 l loading dye vào 8 l sản phẩm RT-PCR - Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
- Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6l maker 100bp và 10l sản phẩm PCR mỗi giếng.
- Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
- Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.