PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.8. Phương pháp gây tối miễn dịch cho chuột lang và thỏ
Bố trí 3 lô chuột lang (gồm 2 lô thí nghiệm tương ứng với 2 loại kháng nguyên: CL1 và CL2 + 1 lô đối chứng CLĐC) và 3 lô thỏ (gồm 2 lô thí nghiệm tương ứng với 2 loại kháng nguyên: T1 và T2 và 1 lô đối chứng TĐC). Chuẩn bị chuột lang 4-6 tuần tuổi, thỏ 3-4 tháng tuổi khỏe mạnh không có kháng thể kháng PRRS và được theo dõi trong 2 tuần.
Gây tối miễn dịch cho thỏ và chuột lang bằng cách tiêm 2 lần kháng nguyên đã tinh chế (khoảng 20µg kháng nguyên/lần) vào dưới da, 2 bên lưng, mỗi lần tiêm cách nhau 14 ngày. Tiến hành lấy máu sau 14 ngày tiêm kháng nguyên lần 1 và 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên lần 2 để kiểm tra kháng thể kháng virus PRRS trong huyết thanh chuột và thỏ.
Lô chuột thí nghiệm Lô thỏ thí nghiệm
Lô CL1 Lô CL2 Lô CLĐC Lô T1 Lô T2 Lô TĐC Số lượng (n=10) (n=10) (n=5) (n=8) (n=8) (n=4) Tiêm kháng nguyên Kháng nguyên tinh chế từ chủng virus KTY- PRRS-01 Kháng nguyên tinh chế từ chủng virus KTY- PRRS-02 Không tiêm kháng nguyên Kháng nguyên tinh chế từ chủng virus KTY- PRRS-01 Kháng nguyên tinh chế từ chủng virus KTY- PRRS-02 Không tiêm kháng nguyên Số lần tiêm kháng nguyên
2 lần 2 lần Không tiêm 2 lần 2 lần Không
tiêm Liều tiêm kháng nguyên 20µg kháng nguyên 20µg kháng
nguyên Không tiêm
20µg kháng nguyên 20µg kháng nguyên Không tiêm
Vị trí tiêm
Tiêm dưới da, hai bên
lưng
Tiêm dưới da, hai bên
lưng
Không tiêm
Tiêm dưới da, hai bên
lưng
Tiêm dưới da, hai bên
lưng Không tiêm Lấy máu 2 lần (sau mỗi lần tiêm kháng nguyên 14 ngày) 2 lần (sau mỗi lần tiêm kháng nguyên 14 ngày) 2 lần (sau mỗi lần tiêm kháng nguyên 14 ngày) 2 lần (sau mỗi lần tiêm kháng nguyên 14 ngày) 2 lần (sau mỗi lần tiêm kháng nguyên 14 ngày) 2 lần (sau mỗi lần tiêm kháng nguyên 14 ngày) 3.5.9. Phương pháp IPMA
Các bước tiến hành của phương pháp bao gồm Bước 1: Chuẩn bị tế bào Marc 145 trên giếng 96
- Chuẩn bị dung dịch tế bào Marc 145 (5x104 tế bào/ml, 10ml mỗi khay) trong DMEM 5% FCS.
- Chia 100μl của dung dịch tế bào này vào các giếng.
- Ủ ở 37C trong 1-2 ngày cho đến khi các tế bào trở nên đơn lớp. Bước 2: Gây nhiễm tế bào với virus PRRS
- Pha loãng virus để được 500 TCID50 /ml
- Thêm 100μl virus đã pha loãng vào tất cả các giếng. - Ủ ở 37C trong 2 ngày.
Bước 3: Cố định các tế bào Marc145 bị nhiễm virus - Loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào
- Thêm 100µl PBS có 10% formalin và 1% NP40 - Ủ ở 37C trong 30 phút
- Rửa khay 2 lần với đệm PBS có 0.5% Tween 80 Bước 4: gắn kháng thể 1
- pha loãng huyết thanh theo tỉ lệ thích hợp * Đối với mục đích sàng lọc 1/160
* Đối với kháng thể chuẩn độ pha loãng 4 lần (1/40, 1/160, 1/640, 1/2560) - Chuyển 50ul của huyết thanh loãng vào từng giếng của đĩa thí nghiệm. - Ủ ở 37C cho 30 phút.
- Rửa khay 3 lần với đệm PBS có 0.5% Tween 80
Bước 5: gắn kháng thể thứ 2; Kháng thể -lợn IgG peroxidase liên hợp - Pha loãng kháng thể thứ 2 với tỉ lệ 1/600 với dung dịch đệm
- Thêm 50µl của kháng thể thứ 2 đã pha loãng vào từng giếng. - Ủ ở 37 ° C trong 30 phút.
- Rửa khay 3 lần với đệm PBS có 0.5% Tween 80 Bước 6: Cho cơ chất
- Thêm 50µl dung dịch AEC (E) vào từng giếng. - Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Quan sát kết quả với kính hiển vi đảo ngược.
3.5.10. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm
Luận văn có sử dụng một số phần mềm để phân tích và xử lý số liệu như: Microsoft Office Excel 2007, MEGA6, Genetyx,...
Phân tích xác nhận chuỗi gene thu được qua chương trình Blast trên ngân hàng gene (GenBank). Truy cập vào ngân hàng gene để thu nhận và xác định tính tương đồng về nucleotide của các chuỗi gene tương ứng của virus với các phân đoạn gene thu được trong nghiên cứu. Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gene của chủng virus thu nhận bằng phần mềm Genetyx (version 5.0.4) và MEGA6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) version 6.0. Sử dụng phương pháp test neighbor-joining với giá trị bootstrap là 1000 đơn vị.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM
4.1.1. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
Virus tai xanh có thể được nhân lên trên tế bào PAM, tế bào thận khỉ xanh châu Phi (African green monkey kidney) (MA-104) và dẫn xuất là tế bào CL- 262t, Marc 145. Theo Kim et al. (1993) đã chỉ ra việc sử dụng dòng tế bào Marc 145 là thích hợp cho việc phân lập virus PRRS.
Để nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào theo thời gian của các chủng virus PRRS nghiên cứu. Tiến hành gây nhiễm 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 và chủng virus vắc-xin lên môi trường tế bào Marc 145 nhằm đánh giá khả năng nhân lên của các chủng virus này trên môi trường tế bào ở các thời điểm sau khi gây nhiễm virus.
Kết quả theo dõi sự nhân lên của các chủng virus PRRS gây nhiễm trên môi trường tế bào với MOI = 0,1 được thể hiện qua sự phát triển bệnh tích tế bào (CPE) được thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
Mẫu KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02
CPE theo thời gian sau khi gây
nhiễm virus 24 giờ 0 0 36 giờ 10 10 48 giờ 35 45 60 giờ 75 85 72 giờ 85 100 84 giờ 100 B 96 giờ B B
(tính theo% diện tích tế bào bị phá hủy so với tổng số diện tích đáy bình nuôi cấy)
Chú thích: B: Toàn bộ tế bào bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy
10*: 10% tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy (ước lượng bằng mắt khi soi trên kính hiển vi soi nổi)
Cả hai chủng virus nghiên cứu đều có khả năng phát triển, nhân lên trên môi trường tế bào Marc 145. Các tế bào bị nhiễm virus co cụm lại với nhau chồi
lên khỏi đáy bình nuôi cấy và khi tế bào bị virus phá hủy hoàn toàn thì bong khỏi đáy bình, có thể quan sát rõ hình thái bệnh tích này qua kính hiển vi soi ngược. Kết quả này cũng được chỉ ra trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và Lương Quốc Hưng (2012) khi tiến hành phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào Marc 145.
Bệnh tích tế bào (CPE) của 02 chủng virus nghiên cứu xuất hiện sớm, chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều gây phá hủy tế bào ở 36 giờ sau khi gây nhiễm. Tế bào bị phá hủy muộn nhất là 84 giờ sau khi gây nhiễm. Như vậy theo dõi phân lập virus PRRS cần quan sát 4 ngày để đảm bảo thu được chính xác kết quả.
Qua theo dõi bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS đang nghiên cứu tại các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ, thấy rằng cả hai chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều có có khả năng gây bệnh tích tế bào tương tự nhau. Bệnh tích bắt đầu xuất hiện vào lúc 36 giờ sau khi gây nhiễm virus KTY-PRRS-01, CPE đạt 10%, số lượng tế bào bị phá hủy tăng dần sau 48 giờ gây nhiễm đạt 35% (KTY-PRRS-01), đạt 80% ở thời điểm 60 giờ sau gây nhiễm virus KTY-PRRS-01 và đến 84 giờ sau gây nhiễm các tế bào đều bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy.
Tương tự, chủng virus KTY-PRRS-02 có bệnh tích tế bào xuất hiện muộn hơn, bệnh tích bắt đầu xuất hiện vào lúc 36 giờ sau gây nhiễm với CPE đạt 10%, số lượng tế bào bị phá hủy tăng dần sau 48 giờ với CPE khoảng 45%, ở thời điểm 60 giờ sau gây nhiễm bệnh tích tế bào đạt xấp xỉ 85%. Tại thời điểm 72 giờ sau khi gây nhiễm, CPE đạt 100%, và đến 84 giờ tế bào đã bị phá hủy và bong tróc hoàn toàn.
MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH TẾ BÀO CỦA 2 CHỦNG KTY-PRRS-01, VÀ KTY-PRRS-02
Hình 4.1. Tế bào Marc 145 không gây nhiễm virus (10X) không gây nhiễm virus (10X)
Hình 4.2. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01
(20X)
Hình 4.3. Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01
(20X)
Hình 4.4. Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02
(10X)
Hình 4.5. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02
(10X)
Hình 4.6. Bệnh tích tế bào sau 84 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01
Bệnh tích quan sát được trên môi trường nuôi cấy tế bào đã được kiểm tra lại bằng phương pháp RT-PCR. Kết quả cho thấy đều có sự xuất hiện của virus trên môi trường nuôi cấy. Như vậy có thể kết luận rằng cả 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus PRRS vắc-xin đều có khả năng gây bệnh tích tế bào trên môi trường Marc 145.
4.1.2. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
Trong nghiên cứu này sử dụng tế bào Marc 145 để gây nhiễm 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 nhằm xác định hiệu giá virus (TCID50), kết quả được thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả xác định hiệu giá của 03 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
STT Tên chủng virus Hiệu giá virus TCID50/25µl
1 KTY-PRRS-01 1,74x106
2 KTY-PRRS-02 3,16x106
Nghiên cứu đã tiến hành xác định hiệu giá virus (TCID50/25µl) của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Qua kết quả xác định hiệu giá virus (TCID50) của 02 chủng virus PRRS được gây nhiễm trên môi trường tế bào Marc 145, kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng virus này có hiệu giá tương đối cao, có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào Marc 145. Chủng virus KTY-PRRS-02 có hiệu giá cao với TCID50/25µl là 3,16 x106, tiếp theo là chủng KTY-PRRS-01 có hiệu giá tương đối cao với TCID50/25µl là 1,74 x106. Giá trị hiệu giá này có thể được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn nhằm phục vụ cho chọn chủng sản xuất vắc-xin phòng bệnh. So sánh về đặc tính sinh học giữa 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 với các chủng trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và Lương Quốc Hưng (2012) cho thấy có nhiều điểm tương đồng về thời gian xuất hiện bệnh tích là tương đối sớm.
4.1.3. Kết quả nghiên cứu xác định sự nhân lên của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 PRRS-01 và KTY-PRRS-02
Tiến hành xác định hiệu giá TCID50 những ống virus thu được để định lượng virus. Kết quả theo dõi hiệu giá virus ở các thời điểm đã quy định của chủng KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 được trình bày ở hình 4.7 hình 4.8.
Kết quả mô tả sự nhân lên của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY- PRRS-02 và chủng virus vắc-xin có thể thấy hàm lượng virus giải phóng tự do
ngoài tế bào cao hơn hàm lượng virus ở trong tế bào. Tại các thời điểm giống nhau, hàm lượng virus PRRS của 02 chủng nghiên cứu đều tồn tại ngoài tế bào cao hơn hàm lượng virus vắc-xin tồn tại trong tế bào. Lượng virus vắc-xin trong tế bào tăng sau 24 giờ gây nhiễm, bắt đầu tăng mạnh đến thời điểm 48 giờ sau gây nhiễm. Trong khi đó, chủngvirus KTY-PRRS-01 và chủng virus KTY- PRRS-02 ở thời điểm 24 giờ khi bệnh tích tế bào xuất hiện chưa rõ ràng và chưa thể quan sát được CPE ở thời điểm này thì lượng virus bên trong tế bào nhiều hơn và chưa giải phóng ra bên ngoài. Từ thời điểm 36 giờ – 48 giờ sau khi gây nhiễm virus, bệnh tích tế bào đã quan sát được rõ ràng thì hàm lượng virus trong tế bào liên tục tăng. Kết quả là lượng virus của chủng KTY-PRRS-01 trong tế bào nhân lên nhanh chóng và đạt đỉnh cao ở 72 giờ sau gây nhiễm với giá trị log TCID50 là 5,5 và chủng virus KTY-PRRS-02 có lượng virus trong tế bào đạt đỉnh cao ở 60 giờ sau gây nhiễm, còn đối với virus vắc-xin giá trị này đạt cao nhất là 5,5 ở thời điểm sớm nhất (48 giờ sau gây nhiễm).
Hình 4.7. Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-01
Tại thời điểm từ 36 giờ - 48 giờ sau khi gây nhiễm, lượng virus giải phóng tự do của chủng virus KTY-PRRS-01 tăng với giá trị log TCID50 tăng từ 3,5 tới 4,5. Lượng virus giải phóng tự do của chủng virus KTY-PRRS-02 tăng với giá trị log TCID50 tăng từ 3,5 tới 4,83. CPE tại thời điểm 48giờ sau gây nhiễm tăng so với thời điểm 36 giờ sau gây nhiễm, đây là thời điểm chủng virus nghiên cứu này phát triển yếu trong tế bào, hàm lượng virus tự do tăng do lượng tế bào bị virus phá vỡ tăng mạnh, virus được giải phóng ra môi trường nuôi cấy. Nhưng cũng trong thời gian này thì virus vắc-xin tăng cường xâm nhập vào tế bào và nhân lên trong tế bào dẫn đến hàm lượng virus trong tế bào tăng.
Thời điểm 72 giờ – 84 giờ sau khi gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02 và 60giờ sau khi gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01, tế bào bị phá hủy gần như hoàn toàn thì lượng virus giải phóng ra bên ngoài tế bào tăng lên và đạt mức cao ở 60 giờ-84 giờ sau khi gây nhiễm, điều này tương ứng với hàm lượng virus trong tế bào giảm dần và đạt mức thấp tại 96 giờ sau khi gây nhiễm, vì lúc này tế bào đã bị phá hủy và bong tróc hoàn toàn. Đối với chủng virus vắc-xin, thời gian từ 48 giờ đến 72 giờ sau gây nhiễm, virus tăng cường giải phóng khỏi tế bào, quá trình xâm nhập và nhân lên trong tế bào của virus diễn ra chậm.
Cả chủng virus vắc-xin và 02 chủng virus nghiên cứu đều thể hiện rằng chúng xâm nhập và nhân lên trong tế bào mạnh hay yếu tùy từng thời điểm nhất định. Như vậy, sự nhân lên của virus khi nuôi cấy trên môi trường tế bào không phải là một quá trình liên tục và đồng đều. Trong đó, những thời điểm phát triển mạnh trong tế bào hay ngoài tế bào của các chủng virus không giống nhau hoàn toàn trong toàn bộ thời gian sau khi đem gây nhiễm virus trên môi trường tế bào Marc 145. Kết quả của luận văn phù hợp với kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và Lương Quốc Hưng (2012) và Nguyễn Bá Hiên và cs. (2015). Kết quả này cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và cs. (2016) khi nghiên cứu về một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-04 qua các đời cấy truyền.
Qua nghiên cứu một số đặc tính sinh học của 02 chủng virus KTY-PRRS- 01 và KTY-PRRS-02 thấy rằng cả 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus PRRS vắc-xin đều có khả năng gây bệnh tích tế bào trên môi trường Marc 145, có quy luật nhân lên trong môi trường tế bào là giống nhau. Virus giải phóng ra ngoài tế bào có hiệu giá cao hơn virus ở trong tế bào. Thời điểm hiệu giá virus đạt cao nhất được xác định trong khoảng 60 giờ đến 84 giờ sau gây
nhiễm. Điều này rất có ý nghĩa trong việc xác định thời gian và phương pháp để thu hoạch được lượng virus là cao nhất.
4.1.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus KTY – PRRS-01 và KTY-PRRS-02 virus KTY – PRRS-01 và KTY-PRRS-02
4.1.4.1. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus PRRS
Từ 2 chủng virus KTY–PRRS–01, KTY-PRRS-02 được lựa chọn và được nhân lên trên môi trường tế bào Marc 145 với số lượng lớn, chúng tôi đã tiến hành tinh chế kháng nguyên virus bằng máy siêu ly tâm của hãng Beckman