2.2.3.1. Một số nghiên cứu trên thế giới về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS
Genome của PRRSV là một sợi đơn RNA và virus là thành viên của họ
Arteriviridae thuộc lớp Nidovirales. Dựa trên phân tích về phát sinh loài virus phân lập khác nhau trên thế giới của Nelson et al. (1993) PRRSV có thể được phân biệt thành hai kiểu gene: loại I, European gienotype gồm virus thuộc dòng châu Âu, đại diện là chủng Lelystad (LV), gồm 3 subtype đã được xác định trong đó, subtype 1 được chia thành 12 clade khác nhau, subtype 2 được chia thành 9 clade (Shi et al., 2010); loại II: Northern American gienotype gồm những virus thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu là chủng virus Bắc Mỹ ATCC - VR2332. PRRSV phân lập ở Trung Quốc được chỉ định là thành viên của kiểu gene II. Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy rằng PRRSV là rất khác nhau về kháng nguyên, độc lực và đa dạng trình tự nucleotide. Sợi đơn RNA của virus bao gồm một bộ gene có khoảng 15 kb, mã hóa 9 ORFs. Bộ gene PRRSV bao gồm hai gene polymerase là ORF1a và ORF1b và bảy gene cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6, và 7. ORF1a và ORF1b cấu thành khoảng 75% bộ gene của virus và được đặc trưng bởi một quá trình khung ribosome chuyển dịch thành một polyprotein lớn mà sự tự phân tách làm phát sinh các protein không cấu trúc (NSP) bao gồm cả RNA phụ thuộc polymerase. Các khung đọc mở ORF2a, 3, 4 và 5 tất cả mã hóa cho các protein glycosyl hóa là GP2a, GP3, GP4, GP5 tương ứng (Harel et al.,1988). Các ORF2b mới được định nghĩa mã hóa các protein nhỏ nhất của các hạt virus được chỉ định GP2b. ORF7 mã hóa các protein nucleocapsid không glycosyl hóa (N), chiếm 20-40% của hàm lượng protein của virion. ORF6 mã hóa các protein tương tự như vậy không glycosyl hóa (M). Heterodimers thành lập bởi GP5 và M đã được tìm thấy trong lưới nội chất của tế bào nhiễm bệnh (Jaffe, 1981), và đã được đề xuất được tham gia vào thụ thể tương tác với tế bào nhiễm virus. Sự hiện diện của virus có đặc tính di truyền khác nhau trong các lợn nhiễm PRRS có thể làm phức tạp việc kiểm soát bệnh bằng cách tiêm chủng, bởi vì hiệu quả vắc-xin phòng PRRS bị giảm khi virus đương nhiễm là một loại virus của một kiểu gene khác (Lou et al., 1993) hay của một nhóm phát sinh khác trong cùng một kiểu gene của chủng vắc-xin gốc.
Về tính đa dạng di truyền, virus PRRS có hai prototyp, phân lập ở châu Âu (virus Lelystad-LV) và phân lập ở Bắc Mỹ (VR-2332). Ngoài sự khác biệt giữa
các lần phân lập,một số nghiên cứu đã chứng minh được có sự biến dị di truyền mạnh trong cả hai tuyp phân lập, được khẳng định qua phân tích trình tự Nucleotid và Aminoacid của các khung đọc mở (ORFs) của LV và VR-2332. Trình tự Aminoacid của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4&5), 91% (ORF6) và 74% (ORF7). Phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hóa do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gene. Theo Murtaugh et al. (1995), Meng et al. (1995) và Nelsen et al. (1999) các chủng virus này gây bệnh trên động vật cảm thụ với bệnh cảnh giống nhau nhưng chúng lại đại diện cho 2 genotyp khác biệt.
Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong các virus được phân lập từ các vùng địa lý khác nhau. Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗi nucleotid khá cao đến 20% về trình tự và số lượng ribonucleotide, điển hình là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ. Chủng Bắc Mỹ có 3 subtyp: VR-2332, Taiwan và 807/94 phân lập ở Canada. Chủng châu Âu có 2 subtyp: I10 phân lập tại Hà Lan và Olot tại Tây Ban Nha.
Tổng độ dài của hệ gene của chủng virus VR2332 phân lập tại Mỹ (số đăng ký: AY 150564) thuộc genotype II, đại diện dòng Bắc Mỹ là 15451 bp, trong đó phần mã hóa sử dụng cho 7 khung đọc mở là 15071bp. Hệ gene của virus PRRS chủng GD (Quảng Đông) (số đăng ký: EU 109503) đại diện cho một nhóm PRRS mới phân lập gần đây có độc lực rất cao ở Trung Quốc, cũng thuộc genotuyp II, dòng Bắc Mỹ, có độ dài là 15353 bp, trong đó phần mã hóa sử dụng cho 7 khung đọc mở là 14981 bp Tian et al. (2007). Bên cạnh đó, Xiaofang Hao và cộng sự đã nêu đặc điểm gene ORF7 của virus PRRS ở Trung Quốc trong một bài báo đăng trên tạp chí Virology. Tác giả của bài báo giải thích rằng, virus PRRS thể hiện sự biến đổi gene rộng rãi. Việc bùng phát dịch bệnh PRRS độc lực cao vào năm 2006 đã khiến cho họ phải nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền của virus PRRS tại Trung Quốc. Để đạt được điều này, họ đã phân tích trình tự các gene NSP2 và ORF7 của 98 chủng virus PRRS Trung Quốc phân lập. Phân tích sơ bộ cho thấy những chủng virus PRRS độc lực cao có một acid amin ở vị trí 30 bị xóa mất trong chuỗi protein không cấu trúc (NSP2) là những chủng virus chủ yếu đang lưu hành tại Trung Quốc. Phân tích sâu hơn dựa trên trình tự gene ORF7 cho thấy tất cả các chủng phân lập ở Trung Quốc được chia thành 5 nhóm phụ, và các chủng virus PRRS độc lực cao không có liên quan đến vắc-xin MLV hay CH-1R, điều này làm tăng nghi ngờ về hiệu quả của các loại vắc-xin này.
Một số nghiên cứu khác về gene ORF5: ORF5 là gene mã hóa cho một glycoprotein xuất hiện phần lớn trên bề mặt của virus PRRS. Trình tự protein GP5 được dự đoán có chứa vùng trình tự tín hiệu (từ amino acid 1-32), 2 vùng trình tự ectodomain ngắn (từ amino acid 32-64 và amino acid 89-109) và vùng trình tự endodomain (từ amino acid 110-200) (Li and Murtaugh, 2012; Kim et al., 2014). Nghiên cứu mức độ tương đồng của gene ORF5 cho thấy, các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam có mức độ tương đồng cao với các chủng của Trung Quốc (Metwally, 2010). Đây là protein đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhiễm của virus PRRS vào tế bào kí chủ và có chứa một số epitop quan trọng trong việc tạo đáp ứng miễn dịch của lợn (Gonin et al.,1999).
Những nghiên cứu chuyên sâu về cấu trúc virus PRRS và đáp ứng miễn dịch của cơ thể lợn mắc PRRS đã có những thành tựu đáng kể: cấu trúc protein của virus, trình tự hệ gene hay thậm chí các epitop trên bề mặt virus cũng đã được xác định. Các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và sản xuất các loại vắc-xin nhằm kiểm soát và phòng chống bệnh. Một số vắc-xin hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới bao gồm các vắc-xin nhược độc như Progressis, Suvaxyn PRRS, Ingelvac PRRS KV, Suipravac PRRS hay các vắc-xin nhược độc như Amervac PRRS, Pyrsvac 183, Porcilis PRRS, Ingelvac PRRS MLV. Tuy nhiên, hiện tại những vắc-xin này vẫn không đáp ứng được yêu cầu về kiểm soát và phòng chống PRRS trên thế giới. Nhiều hướng nghiên cứu phát triển vắc-xin cũng được đề cập tới; Prieto (2010) đã nghiên cứu sản xuất vắc-xin dưới đơn vị GP5 (một loại epitop của PRRSV) hay nghiên cứu tổ hợp GP5 vào tế bào thực vật Chia et al. (2010).
2.2.3.2. Một số nghiên cứu trong nước về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS
Dịch tai xanh thực sự nổ ra tại Việt Nam vào năm 2007, bắt đầu từ ổ dịch tại Hải Dương. Cho đến nay, dịch PRRS đã lan rộng và vẫn đang lưu hành trên cả nước. Các nghiên cứu về PRRS trong nước đã và đang được tiến hành. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn cần nghiên cứu các chủng virus đang lưu hành tại Việt Nam nhằm sản xuấtvắc-xin phòng PRRS, cũng như các chế phẩm sinh học để chẩn đoán, phòng trị PRRS. Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy rằng PRRSV là rất khác nhau về kháng nguyên, độc lực và đa dạng trình tự nucleotide. Những nghiên cứu còn cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong các virus được phân lập từ các vùng địa lý khác nhau. Bản thân các virus trong cùng một nhóm
cũng có sự thay đổi về chuỗi nucleotid khá cao đến 20% về trình tự và số lượng ribonucleotide, điển hình là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007). Nghiên cứu của Đỗ Hải Quỳnh và cs. (2016) khi phân tích đa dạng di truyền gene ORF5 của một số chủng virus phân lập tại miền Bắc, Việt Nam từ năm 2011-2013 cũng chỉ ra mức độ tương đồng về nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứuvới chủng JXA1 là rất cao, trong khoảng 97,6%-99% và mức độ tương đồng với chủng VR2332 thấp hơn, trong khoảng 88,2%-89,2%. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hằng và cs. (2016) khi tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của 03 chủng virus gây rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (HT-07, QT-10, HD-13) phânlập tại Việt Nam từ các ổ dịch năm 2007, 2010, 2013 đã chỉ ra trình tự nucleotide của gene ORF5 có tỷ lệ tương đồng cao với nhau (98,7%-99,4%) và với một số chủng virus PRRS được phân lập từ năm 2006-2007 (trong đó có chủng JXA1) là trên 99%. Đỗ Tiến Duy và Nguyễn Tất Toàn (2016) đã đưa ra công bố về sự tương đồng gene giữa các chủng virus PRRS độc lực cao thu thập tại thực địa với chủng vắc-xin thương mại trên thị trường Việt Nam.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Khoa Thú y Phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý Thú y
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Thời gian nghiên cứu từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017.
3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Thông tin sơ bộ về nguồn gốc của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02.
02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 được Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập từ mẫu bệnh phẩm thu thập từ 02 trang trại thuộc 2 tỉnh Thái Bình và Nghệ An vào năm 2013.
Bảng 3.1. Thông tin về nguồn gốc 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
STT Tên chủng Cơ quan phân lập Đối tượng lấy mẫu Địa phương lấy mẫu Năm thu mẫu
1 KTY-PRRS-01 Phổi Lợn nái
mang thai Thái Bình 2013
2 KTY-PRRS-02 Hạch phổi Lợn nái
mang thai Nghệ An 2013
Các chủng virus PRRS trên đều được phân lập từ các mẫu cơ quan của lợn có triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh PRRS.
Máy móc, trang thiết bị, hóa chất và dụng cụ
Các máy móc, trang thiết bị được sử dụng trong các thí nghiệm: Máy PCR, máy giải trình tự gene, thiết bị điện di, máy chụp ảnh gel, tủ nuôi cấy tế bào, kính hiển vi soi ngược, ...
Hóa chất và dụng cụ: bộ kít tách chiết RNA, kít RT-PCR, kít giải trình tự gene, kít Elisa, DMEM, tế bào Marc 145, FCS, Kit BCA, ống eppendorf, đầu tuyp, Fancol 15 ml, Fancol 50ml, xilanh, kim lấy máu, khay mẫu và khay đệm cho giải trình tự gene, ..
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 01, KTY-PRRS-02
- Xác định hiệu giá của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. - Xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS- 01, KTY-PRRS-02.
- Xác định đường biểu diễn sự nhân lên của virus
- Nghiên cứu khả năng gây miễn dịch của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 cho động vật thí nghiệm
+ Tinh chế kháng nguyên và tiêm cho động vật thí nghiệm
+ Thu huyết thanh và xác định hàm lượng kháng thể bằng phương pháp IPMA
3.4.2. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 01, KTY-PRRS-02 01, KTY-PRRS-02
- Giải trình tự gene của chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 - Xây dựng cây sinh học phân tử cho thấy mối quan hệ di truyền của 2 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 với các chủng virus khác trong ngân hàng gene.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào 3.5.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
- Khôi phục tế bào
Chuẩn bị môi trường đầy đủ (DMEM, 10% FBS làm ấm trong tủ ấm 37oC trong 30 phút trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy)
Bước 1: Giải đông tế bào Marc 145 ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: Chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường đầy đủ. Bước 4: Đưa vào nuôi cấy và theo dõi sự phát triển của tế bào. Giữ tế bào ở 370C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
- Cấy chuyển tế bào
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS (không chứa Ca2+ hoặc Mg2+).
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin - EDTA. Ủ trong 5 đến 10 phút. Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại căn màu trắng. Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml môi trường đầy đủ. Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi tính số tế bào trong 1ml.
Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/ bình T75).
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C, 5%CO2
hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào. - Thu tế bào
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào chỉ khác ở bước 5 và bước 6.
Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5x106 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1ml/ống.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20oC trong 2- 3 giờ, chuyển sang -80oC qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng.
3.5.2. Phương pháp gây nhiễm virus PRRS trên tế bào
Phương pháp gây nhiễm virus trên tế bào là phương pháp khoa học tiên tiến được sử dụng rộng rãi trong Y học để nghiên cứu các virus như: phân lập, nuôi cấy, giám định, chuẩn độ, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt dùng các môi trường tế bào tổ chức để nuôi cấy các vắc-xin virus. Với nhiều loại virus sự nhân lên của chúng tiến triển song song với sự thoái hoá của các tế bào nuôi, một số virus gây bệnh cho tế bào rất đặc trưng. Những biến đổi có tính chất đặc trưng đó gọi là sự huỷ hoại của tế bào chủ (Cytophathogenic Effect - CPE) hoặc các ổ tế bào bị hoại tử. Mỗi ổ tế bào bị hoại tử đó được gọi là một đơn vị plague, có thể đánh giá được khối lượng virus gây nhiễm bằng số đơn vị plague xuất hiện. Có những tế bào bị nhiễm virus chưa đến mức bị chết nhưng chức năng của tế bào này đã bị thay đổi.
Căn cứ vào CPE khi phân lập virus quan sát được dưới kính hiển vi soi ngược có thể đánh giá được hiệu quả phân lập, nuôi cấy virus.
Phương pháp gây nhiễm virus cho tế bào Marc 145 (chai T25). Vật liệu gây nhiễm cho mỗi chai tế bào T25 là 200µl huyễn dịch virus PRRS. Mỗi chủng virus nghiên cứu được gây nhiễm lên tế bào Marc 145 ở MOI=0,1 hàng ngày theo dõi bệnh tích tế bào và ghi chép kết quả, tiến hành theo dõi cho đến khi virus phá hủy hoàn toàn tế bào. Những giếng tế bào có bệnh tích được thu và bảo quản ở -80oC để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.3. Phương pháp xác định TCID50
Chuẩn bị tế bào Marc 145 trên đĩa 96 giếng
Tế bào Marc 145 được trypsin hóa thành huyễn dịch có mật độ 5 x 103 tế bào/ml. Cho 100 µl huyễn dịch tế bào trên vào tất cả các giếng. Đậy nắp, ủ tế bào ở 37 0C trong môi trường 5 % CO2, theo dõi hàng ngày.
Khi quan sát thấy tế bào bám đáy trên 80 % thì tiến hành chuẩn độ vi rút.
Chuẩn độ virus
– Pha loãng vắc xin trong ống nghiệm theo cơ số 10 bằng môi trường nuôi cấy tế bào từ 10-1 đến 10-6 hoặc thấp hơn tùy theo cách bố trí thí nghiệm.