1.3.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng của SRB
Hầu hết SRB có nhu cầu dinh dƣỡng đơn giản và sinh trƣởng tốt trong mơi trƣờng có nguồn cacbon/năng lƣợng ổn định (Muyzer, Stams, 2008). Nguồn cacbon và điện tử thích hợp đối với SRB bao gồm các axít hữu cơ mạch ngắn nhƣ acetate, lactate, pyruvate và rƣợu (Hao et al., 1996). Tuy nhiên, lactate và acetate là nguồn
34
điện tử thƣờng đƣợc sử dụng nhất để phân lập và nuôi cấy SRB trong phịng thí nghiệm (Widdel, Hansen, 1991). Ngoài các hợp chất cacbon hữu cơ, khí hydro có thể làm chất cho điện tử để khử sulfate (Muyzer, Stams, 2008). Một số SRB có thể sinh trƣởng tự dƣỡng với H2 là chất cho điện tử và CO2 là nguồn cacbon duy nhất, nhƣ Desulfotalea psychrophila, Desulfobacterium autotrophicum, Desulfovibrio alaskensis, Desulfovibrio magneticus, Desulfovibrio salexigens (Agostino,
Rosenbaum, 2018).
Phụ thuộc vào cách oxy hóa chất hữu cơ mà SRB có thể đƣợc phân chia thành hai nhóm trao đổi chất nhƣ sau (Muyzer, Stams, 2008).
SRB oxy hóa khơng hồn tồn: oxy hóa các hợp chất hữu cơ đến acetate. Thuộc
nhóm này chủ yếu là các loài thuộc chi Desulfovibrio spp.
SRB oxy hóa hồn tồn: Oxy hóa các hợp chất hữu cơ (bao gồm cả actetate) hoàn
toàn thành CO2. Nhóm này bao gồm các loài SRB thuộc nhiều chi khác nhau, nhƣ
Desulfobacter spp., Desulfobacterium spp., Desulfosarcina spp.
SRB thực hiện oxy hóa các cơ chất hữu cơ sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng (Muyzer, Stams, 2008). Sự khử sulfate thành sulfide tiêu thụ 8 điện tử, và các quá trình sinh hóa thơng qua nhiều bƣớc trung gian với sự tham gia của nhiều enzyme (Hình 1.10) (Grein et al., 2013), trong đó, enzyme khử sulfite dị hóa DSR (đƣợc mã hóa bởi gen dsr) là enzyme quan trọng xúc tác cho phản ứng khử sulfite
(SO32 ) thành sulfide (S2).
Chuỗi phản ứng đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
SO42 → SO32 → HSO3→ HS → S2
35
Ngoài sulfate, SRB cịn có khả năng sử dụng một số hợp chất khác có mức oxy hóa cao làm chất nhận điện tử trong q trình tích lũy năng lƣợng, ví dụ nhƣ NO3, Fe3+. Đặc biệt, gần đây một số lồi thuộc chi Desulfovibrio đƣợc phát hiện là có khả năng sử dụng oxy làm chất nhận điện tử (Muyzer, Stams, 2008).
Bên cạnh đó phải kể đến một số chất đặc biệt khác có thể làm chất nhận điện tử cho SRB nhƣ acrylate, arsenate, chromate hay uranium, các hợp chất chứa clo, do đó nhiều đại diện của SRB đƣợc ứng dụng trong xử lý các chất ô nhiễm độc hại trong môi trƣờng (Muyzer, Stams, 2008).
1.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của SRB
Nhiệt độ. Hầu hết SRB thuộc nhóm ƣa ấm, sinh trƣởng tối ƣu ở nhiệt độ 28 – 38C.
Ở những lồi này, nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến tốc độ của các quá trình sinh học. Khi nhiệt độ giảm, các quá trình này cũng giảm mạnh (Sheoran et al., 2010).
Ngƣợc lại nhiệt độ tăng làm tăng tốc độ trao đổi chất và giảm khả năng hòa tan của H2S gây độc (Kaksonen, Puhakka, 2007). Một số ít SRB ƣa nhiệt và ƣa lạnh cũng đã đƣợc tìm thấy ở các môi trƣờng nhiệt độ khắc nghiệt nhƣ suối nƣớc nóng hay dƣới đáy biển sâu. Những lồi này có thể chịu nhiệt độ từ 6oC đến 57o
C (Ayangbenro et al., 2018).
Độ muối. Dải nồng độ muối từ 1 – 4% NaCl thích hợp đối với sự sinh trƣởng của hầu hết SRB. Tuy nhiên, q trình khử sulfate do vi khuẩn cịn đƣợc quan sát ở các mơi trƣờng khắc nghiệt có độ mặn đặc biệt, ví dụ nhƣ các hồ soda siêu mặn có độ muối trên 150 g/L (Foti et al., 2007).
Nồng độ sulfide. Sulfide có tính độc cao đối với tế bào sinh vật, gây phá hủy các protein và bất hoạt tế bào (Koschorreck, 2008). Phần lớn vi sinh vật chỉ có khả năng hoạt động ở mơi trƣờng khơng có sulfide hoặc sulfide ở nồng độ thấp (< 0,15 – 1,2 mM) (Mirzoyan, Schreier, 2014). Đối với SRB, sự kết tủa các kim loại nguyên tố vết ở dạng sulfide kim loại là cần thiết để giảm nồng độ sulfide trong môi trƣờng, tạo điều kiện cho sự sinh trƣởng (Bharathi et al., 1990). Ngoài ra, các polymer ngoại bào do SRB sinh ra có tác dụng bảo vệ tế bào khỏi sự ảnh hƣởng của chất độc ở mức độ
36
nhất định (Teitzel, Parsek, 2003). Thơng thƣờng, q trình khử sulfate của SRB bị ức chế 50% ở nồng độ H2S trong khoảng 2 – 15 mM và bị ức chế hoàn toàn khi ở nồng độ 16,1 mM (Koschorreck, 2008).
pH. Đa số các loài SRB sinh trƣởng tối ƣu ở pH trung tính 7 – 7,8. Sinh trƣởng của
các lồi này bị ức chế rõ rệt trong mơi trƣờng có pH dƣới 6 hoặc trên 9 (Sánchez- Andrea et al., 2014). Nhiều loài SRB ƣa kiềm (pH tối ƣu 8 – 10) đƣợc tìm thấy trong các mơi trƣờng tự nhiên có pH > 9 (Bernal et al., 2017). Tuy nhiên, số lồi SRB chịu axít (pH < 6) hoặc ƣa axít (pH ≤ 5) đƣợc cơng bố cho tới nay là rất ít (Kovaliova et al., 2017). Ở pH thấp, SRB phải chịu ức chế của nhiều yếu tố có độ độc phụ thuộc
pH mơi trƣờng nhƣ nồng độ cao của proton (H+
) và các ion kim loại nặng, cũng nhƣ từ sản phẩm trao đổi chất của chúng là H2S (Koschorreck, 2008).
Thế oxy hóa khử (Oxidation-reduction potential − ORP). Thế oxy hóa khử phản
ánh các thuộc tính oxy hóa khử của tất cả các chất trong dung dịch, là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến hoạt tính của SRB. Các nghiên cứu chỉ ra rằng, mơi trƣờng khử có ORP ≤ 0,1V là môi trƣờng thuận lợi cho SRB và mơi trƣờng oxy hóa có ORP ≥ 0,1V có thể ức chế hoạt tính của SRB (Wang et al., 2005). Có thể thấy rằng, cặp oxy hóa khử SO42/HS có mức oxy hóa khử khoảng 0,2 V, đứng sau các cặp O2/H2O, NO3/N2, Fe3+/Fe2+, có nghĩa là năng lƣợng tạo ra khi oxy hóa một chất hữu cơ bằng SO42 sẽ thấp hơn so với oxy hóa bằng oxy, NO3 hay Fe3+ (Hình 1.11). Tuy nhiên, ORP và hàm lƣợng sulfate trong mơi trƣờng có thể quyết định khả năng cạnh tranh của quá trình khử sulfate với các quá trình khác (Schink, Stams, 2006). Bên cạnh đó, sản phẩm trao đổi chất sulfide của SRB còn là yếu tố ức chế thứ cấp đối với các loài vi sinh vật khác khi sinh trƣởng trên cùng một loại cơ chất (Stams et al., 2003).
37
Hình 1.11. Các cặp oxy hóa khử quan trọng trong các con đƣờng trao đổi chất ở vi sinh vật
(Thauer et al., 1977)
1.3.2.3. Những đặc tính sinh học quan trọng của SRB ứng dụng trong xử lý AMD
Đặc tính chịu pH thấp. AMD có pH rất thấp (2 – 3), là mơi trƣờng bất lợi đối với hầu hết các sinh vật (Johnson, Hallberg, 2005). Trong các hệ thống xử lý AMD bằng bể sinh học khử sulfate, trƣớc khi đi vào bể khử sulfate AMD đƣợc đƣa qua bể đá vôi để nâng pH, thông thƣờng đạt mức 4 sau thời gian ngắn. Với đặc tính tạo
sulfide và bicacbonat là sản phẩm trao đổi chất, SRB có xu hƣớng sinh trƣởng trong mơi trƣờng trung tính và kiềm (Rabus et al., 2006), thƣờng thực hiện quá trình khử
sulfate tối ƣu ở pH 6 – 8 (Sánchez-Andrea et al., 2014). Ở pH < 5 thì quá trình khử
sulfate diễn ra với tốc độ rất thấp, và ngừng hoàn toàn ở pH 3 (Koschorreck, 2008). Tuy nhiên, một vài nghiên cứu đã cơng bố một số ít các chủng SRB đặc biệt có khả năng thực hiện q trình khử sulfate ở pH < 5 (Karnachuk et al., 2015). Các chủng
SRB chịu pH thấp đã công bố chủ yếu thuộc chi Desulfosporosinus, là nhóm SRB
thuộc họ Peptococcaceae, ngành Firmicutes (Lee et al., 2009; Alazard et al., 2010,
Sánchez-Andrea et al., 2015). Trong khi đó, đa số SRB nằm trong lớp -
Proteobacteria (Rabus et al., 2006) và thuộc nhóm này mới chỉ có 2 chủng Desulfovibrio sp. TomC và Desulfovibrio sp. DV đƣợc phát hiện là có khả năng khử
38
đƣợc phân lập từ mỏ khai thác khoáng sản ở thành phố Tomsk (Nga) (Karnachuk et
al., 2015) và chủng thứ hai đƣợc phân lập từ trầm tích chất thải mỏ Pb-Zn ở thành phố Chita (Nga) (Kovaliova et al., 2017) cho thấy mơi trƣờng khai thác khống sản với pH thấp trong thời gian dài là điều kiện để tạo ra các chủng SRB có khả năng chịu pH thấp, là đặc tính trái với tự nhiên của nhóm này.
Mơi trƣờng có pH thấp là điều kiện sinh trƣởng vô cùng bất lợi đối với SRB do những yếu tố sau:
- Ở pH thấp, H+ có xu hƣớng khuyếch tán qua màng vào trong tế bào, do đó tế bào vi khuẩn cần tiêu tốn năng lƣợng để bơm proton ra ngồi nhằm duy trì pH bên trong (Sánchez-Andrea, 2014). Các lồi sinh vật có hiệu suất sinh năng lƣợng thấp từ quá trình trao đổi chất nhƣ SRB (và nhiều lồi vi sinh vật kỵ khí khác) sẽ mẫn cảm đặc biệt ở pH thấp (Koschorreck, 2008).
- Sản phẩm trao đổi chất của SRB là H2S có tiềm năng gây độc ở pH thấp (Koschorreck, 2008). Ở pH < 5, sulfide tồn tại ở dạng không phân ly duy nhất là H2S có khả năng đi vào tế bào qua màng và gây ức chế trao đổi chất (Koschorreck, 2008). Sulfide tự do có thể gây độc cho tất cả các vi khuẩn do nó phản ứng với các ion kim loại và các nhóm chức năng của các hệ thống vận chuyển điện tử (Hao et al., 1996), các axít amin và các coenzyme trao đổi chất (Koschorreck, 2008).
- Trong số SRB, nhóm oxy hóa khơng hồn tồn các axít hữu cơ tới acetate là nhóm lớn, chiếm đa số (Rabus et al., 2006). Trong dung dịch có pH < 4,57
acetic là dạng chiếm ƣu thế hơn acetate và là dạng gây độc cao đối với vi sinh vật, bao gồm cả các lồi ƣa axít (Sánchez-Andrea, 2014). Ở pH thấp, các nhóm carboxyl trong phân tử axít hữu cơ tồn tại chủ yếu ở dạng không liên kết, có khả năng khuếch tán qua màng vào bên trong tế bào (Koschorreck, 2008). Mơi trƣờng bên trong tế bào có pH cao hơn, làm phân ly các phân tử axít và sinh ra proton tự do khiến tế bào cần tiêu tốn năng lƣợng để bơm proton ra ngồi nhƣ một hình thức tự vệ (Sánchez-Andrea, 2014). Khi nuôi cấy hỗn hợp SRB ở pH khoảng 6,2 thì 50% sinh trƣởng bị ức chế xảy ra ở
39
nồng độ axít acetic không liên kết là 0,9 mM (tƣơng ứng với nồng độ axít acetic tổng số là 25 mM) (Reis et al., 1990). Trong môi trƣờng tự nhiên (quần xã vi sinh vật), acetate sẽ đƣợc sử dụng trong q trình trao đổi chất bởi nhóm kỵ khí khác (nhƣ cổ khuẩn sinh methane) cùng tồn tại với SRB, do vậy tính độc có thể thấp hơn (Sánchez-Andrea, 2014).
Khả năng sống sót của SRB trong mơi trƣờng axít đƣợc chứng minh là do một số cơ chế cân bằng hoặc tiêu thụ proton trong tế bào nhờ enzyme hoặc kênh vận chuyển ion qua màng (Baker-Austin, Dopson 2007; Kovaliova et al., 2017). Cụ thể,
các gen mã hóa cho các protein vận chuyển K+ đã đƣợc tìm thấy trong genome của các chủng SRB có khả năng chịu pH thấp nhƣ Desulfovibrio sp. DV và Desulfovibrio sp. TomC (Kovaliova et al., 2017).
Khả năng chịu kim loại nặng. Trong môi trƣờng pH thấp, các kim loại nặng có xu
hƣớng hình thành các dạng ion tự do, có thể dễ dàng đi vào trong tế bào hơn và làm tăng tính độc của chúng đối với tế bào vi sinh vật (Ayangbenro, Babalola, 2017). Trong tế bào, kim loại nặng thể hiện tính độc theo nhiều cơ chế khác nhau, nhƣ ức chế enzyme, phá hủy axít nucleic, biến tính protein… làm chức năng tế bào bị phá vỡ, giảm tốc độ sinh trƣởng (Bảng 1.6).
Bảng 1.6. Độc tính của các kim loại nặng tới vi sinh vật (Sorokina et al., 2013;
Ayangbenro, Babalola, 2017)
Kim loại Ảnh hƣởng tới vi sinh vật
As Vơ hiệu hóa enzyme
Cd Làm tổn hại axít nucleic, biến tính protein, ức chế phân chia và phiên mã của tế bào, ức chế q trình khống hóa cacbon và nitơ
Cr Kéo dài pha lag, ức chế sinh trƣởng, ức chế sự hấp thụ oxy Cu Phá vỡ chức năng tế bào, ức chế hoạt động của enzyme
Hg Biến tính protein, phá vỡ màng tế bào, ức chế chức năng enzyme, giảm kích thƣớc quần thể
40 trình phiên mã
Ni Phá vỡ màng tế bào, ức chế hoạt động của enzyme, gây mất cân bằng oxy hóa
Se Ức chế sinh trƣởng của tế bào
Ag Ly giải tế bào, ức chế quá trình tải nạp và sinh trƣởng của tế bào Zn Gây chết, giảm sinh khối tế bào và ức chế sinh trƣởng
Fe Peroxy hóa lipid, gây tổn hại protein và axít nucleic
Cũng nhƣ đa số các loài vi sinh vật, SRB chịu tác động độc hại của kim loại nặng, đặc biệt ở điều kiện mơi trƣờng có pH thấp (Koschorreck, 2008). Tuy nhiên, do tạo H2S vốn có khả năng kết tủa phần lớn các ion kim loại, SRB có khả năng chịu tác động của kim loại trong mơi trƣờng cao hơn so với nhiều lồi khác (Koschorreck, 2008). Nghiên cứu trong phịng thí nghiệm cho thấy SRB bị ức chế ở nồng độ Cu, Cd, Ni: 20 mg/L; Zn: 25 mg/L; Cr: 60 mg/L; Pb: 75 mg/L (Hao et al., 1994).
Khả năng khử asen và một số kim loại, á kim khác. Nhiều loại AMD, đặc biệt là
AMD từ hoạt động khai thác vàng, thƣờng có hàm lƣợng arsen cao. Asen đƣợc coi là một chất rất độc với cơ thể sống, tồn tại trong tự nhiên ở các dạng phổ biến nhất là arsenate (As5+) và arsenite (As3+) hịa tan trong nƣớc, trong đó As3+ có độc tính cao hơn đối với sinh vật dƣới nƣớc (Lim et al., 2014). Tuy nhiên, trong mơi trƣờng có
mặt sulfide (S2), As3+ dễ dàng bị loại bỏ khỏi nƣớc nhờ tạo kết tủa As2S3. Một số chủng SRB đã đƣợc chứng minh là có khả năng thực hiện đồng thời việc khử As5+ thành As3+ (phƣơng trình 1.13) và khử sulfate (SO42) thành sulfide (S2) (phƣơng trình 1.12), các sản phẩm khử sau đó kết hợp tạo thành muối sulfide As2S3 ở dạng kết tủa (phƣơng trình 1.14), theo đó cả hai dạng asen đều đƣợc loại ra khỏi nƣớc (Newman et al., 1997; Macy et al., 2000; Li, Krumholz, 2007). Với khả năng này,
SRB đƣợc xem nhƣ tác nhân sinh học chủ chốt trong quy trình xử lý nƣớc nhiễm asen ở điều kiện kỵ khí.
2CH2O + SO42 H2S + 2HCO3 (1.12)
CH2O + 2H2AsO4 + H+ 2H3AsO3+ HCO3 (1.13) 3H2S + 2H3AsO3 As2S3↓vàng + 6H2O (1.14)
41
Một số SRB cũng đƣợc báo cáo là có khả năng khử một số chất độc hại đặc biệt có mặt trong AMD nhƣ Uranium (U), Chromatium (Cr), Tellurium (Te), Vannadium (V), Technetium (Tc)… (Bảng 1.7).
Bảng 1.7. Quá trình khử một số kim loại, á kim nhờ SRB (Barton et al., 2015)
Q trình khử SRB đã đƣợc cơng bố
U6+ → U4+
Desulfovibrio desulfuricans, Desulfomicrobium norvegicum
(trƣớc đây là D. baculatus), Desulfosporosinus orientis và
Desulfosporosinus sp. P3, Desulfarculus baarsii, Desulfovibrio sulfodismutans, Desulfovibrio vulgaris, Desulfovibrio sp. UFZ B
490 và Desulfotomaculum reducens Te6+ → Te4+
Desulfovibrio desulfuricans
Cr6+ → Cr3+ Desulfovibrio sp. Oz7, D. desulfuricans, D. vulgaris,
Desulfomicrobium norvegicum DSM 1741
V5+ → V3+ Desulfovibrio fructosivorans
Tc7+ → Tc4+
D. desulfuricans ATCC 29577