Các phƣơng pháp sinh học phân tử

2.2.2.1. Tách DNA tổng số

Tách DNA từ hỗn hợp vi khuẩn. DNA tổng số của mẫu làm giàu đƣợc tách chiết

theo phƣơng pháp do Zhou và cộng sự (Zhou et al., 1996) mơ tả có thay đổi về nồng độ đệm phosphate (tăng từ 100 mM lên 120 mM) trong đệm tách (gồm: 100 mM Tris (pH 8); 100 mM EDTA (pH 8); 120 mM đệm phosphate (Na2HPO4/NaH2PO4); 1,5 M NaCl; 1% CTAB). Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:

- Trộn 2 mL mẫu với 5,4 mL đệm tách DNA trong ống falcol 50 mL.

- Phá tế bào bằng phƣơng pháp sốc nhiệt trong nitơ lỏng và bể ổn nhiệt ở 37oC, lặp lại 5 lần.

- Bổ sung 40 µL proteinase K (10 mg/ml), lắc ngang với tốc độ 225 vòng/phút trong 30 phút ở 37oC.

56

- Thêm 600 µL SDS (20%), ủ ở 65oC trong 2 giờ, 25 phút đảo lộn đầu một lần. - Bổ sung PCI với lƣợng tƣơng đƣơng về thể tích, sau đó trộn đều. Ly tâm 6000

vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phịng.

- Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, lặp lại bƣớc trên 1 lần.

- Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ.

- Ly tâm thu kết tủa DNA ở 12000 vòng/phút trong 25 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ phần dịch ở trên, rửa kết tủa với 10 mL ethanol 80% lạnh, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.

- Đổ ethanol, để khô ở nhiệt độ phòng.

- Hòa tan DNA trong 50 µL nƣớc MQ đã khử trùng, chuyển DNA sang ống eppendorf 1,5 mL và giữ ở 20o

C.

Tách DNA từ chủng thuần khiết. DNA genome của chủng thuần khiết đƣợc tinh sạch theo phƣơng pháp của Marmur (Marmur, 1961), gồm các bƣớc nhƣ sau:

- 1 mL dịch tế bào đƣợc ly tâm 5000 – 10000 vịng/phút trong 5 phút, sau đó rửa với 1 mL đệm TE (pH 8) rồi hòa tế bào trong 0,5 mL 5 mM EDTA (pH 8) - Thêm 50 µL lysozym (40 mg/mL), trộn đều, ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong

1 giờ.

- Thêm 50 µL SDS (20%) và 50 µL proteinase K (4 mg/mL), trộn đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 55oC trong 1 giờ.

- Thêm 400 µL PCI, trộn đều trong 1 – 3 phút, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút. Lặp lại bƣớc vừa rồi thêm 1 lần.

- Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới. Thêm 1/10 thể tích dung dịch 3M Na-acetate (pH 5,2) và 2 lần thể tích dung dịch 2-propanol, trộn đều và giữ ở -20o

C trong vòng 15 phút đến 1 giờ.

- Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, chắt phần dịch phía trên để thu kết tủa DNA.

- Rửa DNA trong ethanol 70% (đã để lạnh 20oC) trong 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút, đổ cồn, làm khơ DNA ở nhiệt độ phịng.

57

- Hòa tan DNA trong 50 µL MQ vơ trùng (hoặc đệm TE) và bảo quản tại

20C cho các thí nghiệm tiếp theo.

Sản phẩm DNA đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE tại 100 V trong thời gian 15 phút. Sau khi điện di, gel agarose đƣợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/mL) trong 15 phút, sau đó rửa nƣớc và chụp ảnh dƣới tia UV trên máy GelDoc (BioRad).

2.2.2.2. Phương pháp PCR-DGGE

Điện di biến tính (DGGE) là kỹ thuật đƣợc sử dụng để phân tách các đoạn DNA ngắn đến trung bình, dựa trên đặc điểm biến tính của chúng. Kỹ thuật này thƣờng đƣợc sử dụng để xác định tính đa hình nucleotide mà khơng cần giải trình tự DNA. Đây là một phƣơng pháp dấu vân phân tử nhằm phân tích các quần xã vi sinh vật thông qua PCR để khuếch đại các vùng bảo thủ của rDNA hoặc các gen chức năng ở vi sinh vật (Strathdee, Free, 2013).

Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA (550 bp). Vùng V3 - V5 của gen 16S rRNA với độ dài 550 bp đƣợc khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (5’- CCTACGGGAGGCAGCAG-3’) và 907R (5’-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3’) (Muyzer et al., 1993). Để tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên

gel điện di biến tính, kẹp GC gồm 40 bp

(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGCCGGGGCGGGGGCACGGGGGG) đƣợc gắn vào đầu 5’ của mồi GM5F. “Touch-down” PCR (bảng 2.3) đƣợc sử dụng để tăng độ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sản phẩm phụ.

58

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại đoạn

16S rRNA cho phân tích DGGE

Thành phần phản ứng Thể tích

(µL) Chu kỳ nhiệt của “touch-down” PCR

H2O MQ 5,375 Chu kỳ đầu: 94C – 5 phút, 94C –

1 phút, 65C trong 1 phút, 72C – 3 phút;