Các đặc tính sinh học khác liên quan đến xử lý AMD

14 chu kỳ: 94C – 40 giây, 55C

3.3.2. Các đặc tính sinh học khác liên quan đến xử lý AMD

Trong hai chủng SRB mới phân lập, chủng S4 có khả năng chịu pH thấp nổi trội, do vậy đƣợc đánh giá có tiềm năng ứng dụng tốt trong xử lý AMD. Phần tiếp theo là những nghiên cứu chi tiết về các đặc tính sinh học của chủng S4 liên quan đến khả năng ứng dụng trong xử lý AMD.

3.3.2.1. Khả năng chịu muối và chịu nhiệt độ

Do hoạt động khai thác khống sản có thể diễn ra ở môi trƣờng nƣớc ngọt hoặc môi trƣờng nƣớc biển, AMD tạo ra từ các hoạt động này có hàm lƣợng muối khác nhau (Cisternas, Gálvez, 2017). Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nồng độ muối tới sinh trƣởng của chủng S4 đƣợc thực hiện trong mơi trƣờng FWS có bổ sung NaCl ở các nồng độ từ 0 – 25 g/L, hoạt tính khử sulfate đƣợc đánh giá thông qua hàm lƣợng sulfide tạo thành sau 5 ngày (Hình 3.10). Chủng S4 tăng sinh tốt và thể hiện hoạt tính khử sulfate cao ở các nồng độ muối  10 g/L; hoạt tính khử sulfate

giảm mạnh ở nồng độ muối > 10 g/L và gần nhƣ bị ức chế ở nồng độ muối  20 g/L. Bên cạnh đó, tốc độ sinh trƣởng (thể hiện bằng mật độ quang của dịch nuôi ở 600 nm) cũng khá tƣơng đồng với hoạt tính khử sulfate tạo sulfide. Chủng S4 sinh trƣởng tốt nhất ở nồng độ muối  1 g/L, mức sinh trƣởng giảm ở các nồng độ 5, 10, 15 và 20 g/L, và giảm mạnh ở 25 g/L. Đặc biệt lƣu ý, ở các nồng độ muối từ 5 – 10 g/L tốc độ sinh trƣởng giảm rõ rệt, tuy nhiên hoạt tính khử sulfate không thay đổi nhiều. Hiện tƣợng này có thể do mức năng lƣợng tích lũy từ quá trình khử sulfate thấp, dẫn đến không đủ cho vi khuẩn sinh trƣởng.

83

Hình 3.10. Ảnh hƣởng của nồng độ muối trong mơi trƣờng tới mức tăng sinh và hoạt tính

khử sulfate của chủng S4

Thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính khử sulfate và sinh trƣởng của chủng S4 đƣợc tiến hành trên môi trƣờng dịch thể FWS kỵ khí có sulfate (28 mM) làm chất nhận điện tử và lactate (10 mM) làm chất cho điện tử, pH 7, nuôi ở dải nhiệt độ từ 15 – 37C. Kết quả nghiên cứu (Hình 3.11) cho thấy chủng S4 sinh trƣởng và tạo sulfide tốt trong vùng nhiệt độ từ 20 đến 37oC, cao nhất ở 30oC.

Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sinh trƣởng và hoạt tính khử sulfate của chủng S4

N ồn g độ s u lfi d e (mM ) Nồng độ muối (g/L) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0 1 2 3 4 5 0 1 5 10 15 20 25 Nồng độ sulfide OD600 OD600 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 0 1 2 3 4 5 15 20 25 30 37 Nồng độ sulfide OD600 OD600 Nồng độ sulf ide ( mM ) Nhiệt độ (0C)

84

Nhƣ vậy có thể kết luận rằng chủng S4 thuộc nhóm ƣa ấm (mesophilic), là các vi khuẩn khử sulfate phổ biến nhất trong tự nhiên. Khả năng sinh trƣởng và khử sulfate tốt trong khoảng nhiệt độ 20 - 37C, nồng độ muối  10 g/L là đặc điểm cho phép triển khai ứng dụng xử lý AMD ở điều kiện nƣớc ngọt và nƣớc lợ (ven biển), vào phần lớn thời gian trong năm ở Việt Nam.

3.3.2.2. Khả năng sử dụng các chất nhận điện tử khác nhau

Ngoài khả năng sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng để oxy hóa các hợp chất hữu cơ đơn giản và tích lũy năng lƣợng, nhiều lồi SRB cịn có khả năng sinh trƣởng với các chất nhận điện tử khác nhƣ NO3, Fe3+ và thậm chí oxy (Muyzer, Stams, 2008). Khả năng sử dụng các loại chất cho và nhận điện tử khác nhau là một đặc tính quan trọng ở SRB, có ý nghĩa đối với ứng dụng trong xử lý AMD. SRB có khả năng sử dụng nhiều chất cho và nhận điện tử sẽ có ƣu thế cạnh tranh cao trong môi trƣờng xử lý AMD.

Trong nghiên cứu này, các chất nhận điện tử khác nhau gồm có NO3, Fe3+, As5+ đƣợc dùng để nuôi chủng S4 và so sánh với đối chứng (+) là SO42. Hai chất nhận điện tử NO3 và Fe3+ đƣợc sử dụng độc lập với nồng độ tƣơng ứng là 5 mM và 30 mM. Riêng As5+ (5 mM) đƣợc sử dụng kết hợp với SO42 (20 mM) do ở điều kiện này khi As5+ bị khử thành As3+ sẽ kết hợp với S2 từ quá trình khử SO42 tạo thành kết tủa As2S3 màu vàng, có thể quan sát thấy bằng mắt thƣờng. Trong tất cả các trƣờng hợp, lactate (20 mM) đƣợc sử dụng làm chất cho điện tử. Khả năng sử dụng các chất nhận điện tử khác nhau của chủng S4 đƣợc đánh giá thông qua sự giảm nồng độ của các chất này trong môi trƣờng sau 7 ngày nuôi cấy.

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng chủng S4 khơng có khả năng khử Fe3+ (Hình 3.12A), tuy nhiên nó có khả năng khử NO3 (Hình 3.12B) ở mức cao. Tốc độ khử nitrate ở chủng này là 82,67 mg/L/ngày. Cho đến nay, nhiều SRB có khả năng khử nitrate đã đƣợc cơng bố, chủ yếu nằm trong lớp δ-Proteobacteria nhƣ Desulfovibrio

desulfuricans Essex, Desulfovibrio desulfuricans 27774 , Desulfovibrio profundus,

85

(Marietou, 2016); 1 loài thuộc ngành Nitrospirae là Thermodesulfovibrio islandicus

(Sonne-Hansen, Ahring, 1999); và 1 lồi ƣa axít thuộc ngành Firmicute đƣợc phân

lập từ trầm tích sơng có tính axít là Desulfosporosinus acididurans (Sanchez-Andrea

et al., 2015).

Hình 3.12. Khả năng sử dụng Fe3+ (A), NO3 (B) và SO42− (C) làm chất nhận điện tử ở

chủng S4

Đối với As5+, chủng S4 cũng có khả năng khử tốt (Hình 3.13A), lƣợng As2S3 kết tủa màu vàng có thể dễ dàng quan sát đƣợc trong bình ni (Hình 3.13B). Hàm lƣợng SO42 giảm từ 20 mM còn 11 mM và As5+ giảm từ 4,58 mM còn 2,95 mM, tƣơng ứng tốc độ khử As5+

86

năng khử As5+ đã đƣợc cơng bố đến nay, và so về hoạt tính thì chủng S4 khử As5+ ở mức cao hơn chủng Desulfotomaculum sp. OREX-4 trong nghiên cứu của Newman và cộng sự (1997), nhƣng lại thấp hơn ở các chủng Desulfomicrobium sp. Ben-RB, Desulfovibrio sp. Ben-RA, Desulfovibrio sp. G20 trong các nghiên cứu của Macy

(2000), Li và Krumholz (2007) (Bảng 3.2). Tuy nhiên, các chủng SRB có khả năng khử As5+ đã công bố trƣớc đây khơng có đặc tính chịu pH thấp nhƣ chủng

Desulfovibrio oxamicus S4 trong nghiên cứu này.

Hình 3.13. Khả năng khử As5+ ở chủng S4. (A) – Định lƣợng trong mơi trƣờng FWS có bổ

sung arsenate; (B) – Bình ni S4 trong mơi trƣờng FWS có bổ sung arsenate (B1) và trong mơi trƣờng FWS đối chứng (B2)

Bảng 3.2. Hoạt tính khử As5+ của chủng S4 và các chủng SRB đã công bố

Tên chủng vi khuẩn Tốc độ khử As5+ (mg/L/ngày)

Tài liệu tham khảo

Desulfotomaculum sp. OREX-4 9,99 Newman et al., 1997

Desulfomicrobium sp. Ben-RB 166,8 Macy, 2000

Desulfovibrio sp. Ben-RA 92,9 Macy, 2000

Desulfovibrio sp. G20 (cải biến di truyền) 1192,73 Li, Krumholz, 2007

Desulfovibrio oxamicus S4 17,97 Nghiên cứu này

Asen có mặt trong nhiều loại AMD, đặc biệt là từ hoạt động khai thác vàng và một số kim loại màu. Do vậy SRB nhƣ chủng S4 với khả năng khử arsenate thành

87

arsenite và loại khỏi môi trƣờng nƣớc ở dạng kết tủa với sulfide có ý nghĩa ứng dụng rất quan trọng trong xử lý AMD.

3.3.2.3. Khả năng sử dụng các chất cho điện tử khác nhau

Nguồn cơ chất (chất cho điện tử) thông thƣờng nhất của SRB là các chất đơn giản đƣợc hình thành từ q trình lên men yếm khí nhƣ các axít hữu cơ (pyruvate, latate, acetate), rƣợu (methanol, ethanol) và hydro. Để phân biệt khả năng oxy hóa hồn tồn và khơng hồn tồn ở chủng S4, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng sinh trƣởng của chủng với chất cho điện tử là acetate so sánh với lactate. Ngoài ra, methanol, ethanol, glycerol (thuộc nhóm khơng phân ly) và dịch cám gạo lên men (hỗn hợp các chất hữu cơ đơn giản) cũng đƣợc lựa chọn đƣa vào thí nghiệm làm chất cho điện tử. Trong các quy trình xử lý AMD thực tế các chất này đƣợc bổ sung vào bể phản ứng để làm cơ chất cho SRB, qua đó tăng tốc và ổn định quá trình khử sulfate (Doshi, 2006).

Kết quả (Hình 3.14) cho thấy chủng S4 có khả năng sử dụng lactate, methanol, ethanol, glycerol, dịch cám gạo lên men để khử sulfate. Tuy nhiên, chủng này hồn tồn khơng có khả năng sử dụng cơ chất acetate. Kết quả này cũng phù hợp với đặc tính chung của SRB thuộc chi Desulfovibrio, là các lồi oxy hóa khơng hồn tồn điển hình (Widdel, Bak, 1992).

Tuy chủng S4 có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất nhƣ lactate, methanol, ethanol, glycerol, dịch cám gạo lên men nhƣng mức độ oxy hóa các hợp chất này ở các pH khác nhau là không giống nhau. Ở pH thấp (pH 4 và 5), khả năng sử dụng các hợp chất này để khử sulfate là khá đồng đều, thể hiện qua hàm lƣợng sulfate bị khử nằm trong khoảng 4 – 5 mM (ở pH 4) và 6 – 8 mM (ở pH 5). Ở pH trung tính (pH 7), chủng S4 khử sulfate tốt nhất khi sử dụng lactate, ethanol, và dịch cám gạo lên men. Khả năng sử dụng methanol hoặc glycerol để khử sulfate ở pH này chỉ bằng khoảng 50% so với lactate.

88

Hình 3.14. Khả năng sử dụng các chất cho điện tử khác nhau của chủng S4

Với khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất khác nhau để khử sulfate, chủng S4 có lợi thế trong việc xử lý AMD ngoài thực địa. Đặc biệt, chủng S4 khử sulfate với dịch cám gạo lên men ở mức cao gần tƣơng đƣơng với lactate hay ethanol, là yếu tố thuận lợi cho ứng dụng trong thực tế. Cơ chất rẻ tiền nhƣ cám gạo hay rỉ đƣờng cũng đã đƣợc nhóm nghiên cứu Sato và cộng sự (Nhật Bản) sử dụng cho SRB trong xử lý AMD ở mơ hình phịng thí nghiệm (Sato et al, 2018).

3.3.2.4. Khả năng khử sulfate trong mơi trường có hàm lượng cao kim loại nặng

Do có nguồn gốc từ bùn thải AMD, chủng S4 đƣợc mong đợi có khả năng chịu nồng độ các kim loại nặng cao. Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong môi trƣờng sulfate/lactate với từng ion kim loại ở các nồng độ khác nhau và khả năng chống chịu kim loại nặng đƣợc đánh giá thơng qua hoạt tính khử sulfate. Kết quả chỉ ra rằng, chủng S4 khử sulfate tích cực ở nồng độ rất cao của tất các kim loại nặng đƣợc nghiên cứu (Hình 3.15A). Với Fe2+, hoạt tính khử sulfate đƣợc duy trì ở nồng độ Fe2+ lên tới 500 mg/L, giảm nhẹ ở nồng độ Fe2+ > 500 mg/L, và bị ức chế 50% sinh trƣởng ở nồng độ Fe2+  800 mg/L, cho tới 3000 mg/L. Zn2+ và Cu2+ có ảnh hƣởng ức chế đối với tế bào sống cao hơn Fe2+

, hoạt tính khử sulfate của chủng S4 giảm tới 0 2 4 6 8 10 12 14

Lactate Acetate Glycerol Methanol Ethanol Cám lên

men pH4 pH5 pH7 Su lfat e bị khử ( mM )

89

90% ở nồng độ Zn2+ hoặc Cu2+ là 100 mg/L. Tuy nhiên, khả năng chịu kim loại nặng của chủng S4 là cao hơn so với chủng S10 (Hình 3.15B). Chủng S10 khử sulfate tích cực ở nồng độ Fe2+  200 mg/L. Với nồng độ Fe  400 mg/L, hoạt tính khử sulfate

của chủng này giảm 50 – 75%. Chủng S10 nhạy cảm cao với Zn2+ và Cu2+, hoạt tính khử sulfate bị ức chế mạnh ngay cả ở nồng độ Zn2+ hoặc Cu2+ ở mức 20 mg/L.

Hình 3.15. Ảnh hƣởng của các kim loại nặng lên hoạt tính khử sulfate của chủng S4 (A) và

chủng S10 (B)

Ngoài chủng S10, chủng S4 cịn có khả năng chịu kim loại nặng cao hơn nhiều chủng SRB thuộc lớp Proteobacteria đã cơng bố. Ví dụ nhƣ chủng

90

2001); hỗn hợp SRB bị ức chế ở 12 mg/L Cu2+, 20 mg/L Zn2+ (Utgikar et al., 2001); chủng Desulfovibrio sp. (ATCC 49975) và chủng D. vulgaris (ATCC 29579) bị ức

chế ở 9 mg/L Cu2+, 20 mg/L Zn2+ (Cabrera et al., 2006). Khả năng chịu kim loại

nặng của chủng S4 ở mức tƣơng đƣơng so với chủng Desulfosporosinus acididurans M1T (2800 mg/L Fe2+ và 64 mg/L Cu2+), một lồi SRB có khả năng tạo bào tử thuộc ngành Firmicutes (Sánchez-Andrea et al., 2015).

Đặc tính chống chịu tốt trong mơi trƣờng có hàm lƣợng kim loại nặng cao là yếu tố cạnh tranh, giúp chủng S4 tồn tại và sinh trƣởng đƣợc trong môi trƣờng AMD. Vai trò của SRB nhƣ chủng S4 ở giai đoạn bắt đầu quá trình xử lý AMD là rất quan trọng. Với khả năng thích nghi tốt trong mơi trƣờng có pH thấp và hàm lƣợng kim loại nặng cao, chủng S4 bắt đầu thực hiện quá trình khử sulfate tạo sulfide, qua đó tăng pH và giảm nồng độ kim loại nặng trong môi trƣờng, giúp cho các lồi SRB khác có thể bắt đầu sinh trƣởng.