14 chu kỳ: 94C – 40 giây, 55C
3.1.2. Phân lập SRB chịu pH thấp và xác định vị trí phân loạ
3.1.2.1. Phân lập SRB chịu pH thấp
Phân lập các chủng SRB thuần khiết từ mẫu làm giàu EA4 đƣợc tiến hành trên dãy ống thạch bán rắn (1%) chứa mơi trƣờng khống FWS kỵ khí có chất cho và nhận điện tử tƣơng ứng là lactate (10 mM) và sulfate (28 mM) (Widdel, Bak, 1992) (Hình 3.2). Các khuẩn lạc riêng lẻ hình thành trong ống thạch (Hình 3.2A) đƣợc tách bằng capillary thủy tinh (kéo dài từ pipet Pasteur) và chuyển sang ống nghiệm chứa môi trƣờng dịch thể FWS kỵ khí. Quy trình phân lập này đƣợc tiến hành 2 lần để đảm bảo tính thuần khiết của các chủng thu đƣợc. Từ mẫu làm giàu EA4, hai chủng SRB đƣợc phân lập dựa trên hình thái khác nhau của khuẩn lạc và tế bào (Hình 3.2), chủng S4 có khuẩn lạc kích thƣớc lớn, nhƣng tế bào nhỏ và chủng S10 có khuẩn lạc nhỏ nhƣng tế bào kích thƣớc lớn (Bảng 3.1)
Bảng 3.1. Các chủng SRB phân lập đƣợc từ mẫu làm giàu EA4 Tên
chủng
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Hình dạng tế bào Đặc điểm chuyển động của tế bào S10 Hình đĩa lồi 2 mặt, màu đen, kích thƣớc nhỏ (Hình 3.2B) Hình phẩy khuẩn, kích thƣớc 2–2,3 5–8 μm (Hình 3.2D ) Chuyển động nhanh S4 Hình đĩa lồi 2 mặt, màu đen, kích thƣớc lớn (Hình 3.2C) Hình phẩy khuẩn, kích thƣớc 0,6 2–3 μm (Hình 3.2E ) Chuyển động nhanh
74
Hình 3.2. Phân lập SRB từ mẫu làm giàu EA4. (A) – Khuẩn lạc SRB hình thành trong ống
thạch bán rắn kỵ khí; (B) – Hình thái khuẩn lạc của chủng S10; (C) – Hình thái khuẩn lạc của chủng S4; (D) – Hình thái tế bào dƣới kính hiển vi phản pha của chủng S10; (E) – Hình
thái tế bào dƣới kính hiển vi phản pha của chủng S4.
3.1.2.2. Xác định vị trí phân loại của các chủng SRB đã phân lập
Trình tự gen 16S rRNA của hai chủng SRB mới phân lập đƣợc so sánh với các trình tự đã đƣợc công bố trên cơ sở dữ liệu GenBank bằng công cụ BLAST Search, kết quả cho thấy chủng S4 có độ tƣơng đồng 99% so với Desulfovibrio oxamicus, chủng S10 có độ tƣơng đồng 99% so với Desulfovibrio alcoholvorans.
Các trình tự gen 16S rRNA của chủng S4 và S10 đƣợc đăng ký trên ngân hàng dữ liệu DDBJ/GenBank lần lƣợt với mã số là LC186051 và LC469350. Vị trí phân loại của hai chủng S4 và S10 so với các lồi SRB có liên hệ gần gũi dựa trên trình tự gần đủ của gen 16S rRNA đƣợc biểu diễn trên cây phát sinh chủng loại tại hình 3.3A.
Ngồi trình tự gen 16S rRNA, đoạn gen dsrB (mã hóa cho tiểu đơn vị beta
của enzyme khử sulfide dị hóa) của hai chủng S4 và S10 cũng đƣợc giải trình tự và so sánh độ tƣơng đồng với các trình tự của gen này đã đƣợc cơng bố. Kết quả cho thấy chủng S4 có độ tƣơng đồng 98% so với Desulfovibrio oxamicus, chủng S10 có độ tƣơng đồng 99% so với Desulfovibrio sp.. Các trình tự gen dsrB của hai chủng
này đƣợc đăng ký trên ngân hàng dữ liệu GenBank với mã số MN792774 cho chủng S4 và MN792773 cho chủng S10. Cây phát sinh chủng loại dựa trên so sánh trình tự
75
gen dsrB của hai chủng S4, S10 với các trình tự đã cơng bố đƣợc biểu diễn tại hình 3.3B.
Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loại neighbor joining dựa trên trình tự gen 16S rRNA gần đủ
(A) và trình tự gen dsrB (B) của hai chủng SRB S4 và S10 mới phân lập so sánh với các lồi SRB có quan hệ gần gũi. Desulfosporosinus acididurans (thuộc ngành Firmicutes)
76
Trên cơ sở so sánh trình tự gen 16S rRNA và trình tự gen dsrB, hai chủng S4, S10 đƣợc định danh tƣơng ứng là Desulfovibrio oxamicus S4 và Desulfovibrio alcoholivorans S10.
Như vậy, quá trình làm giàu SRB ở điều kiện pH5 sử dụng mẫu bùn thải axít mỏ volfram ở Tuyên Quang đã thành công, tạo ra được tổ hợp SRB có hoạt tính khử sulfate cao và ổn định ở điều kiện pH này. Hai chủng SRB S4 và S10 được phân lập từ mẫu làm giàu và được định danh tương ứng là Desulfovibrio oxamicus S4 và Desulfovibrio alcoholivorans S10 dựa trên các kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA và gen dsrB.