Một số thuật ngữ đƣợc sử dụng trong nghiên cứu:
- Hoạt tính khử sulfate của SRB: đƣợc đánh giá qua hàm lƣợng sulfate bị khử hoặc hàm hƣợng sulfide đƣợc tạo ra.
- Sinh trƣởng của SRB: đƣợc đánh giá qua mật độ tế bào, xác định bằng đo OD600 hoặc đếm số lƣợng tế bào bằng phƣơng pháp MPN.
- Tốc độ tạo sulfide: hàm lƣợng sulfide đƣợc sinh ra trong một đơn vị thể tích trên một đơn vị thời gian.
- Tốc độ khử arsenate: hàm lƣợng arsenate bị khử trong một đơn vị thể tích trên một đơn vị thời gian.
2.2.1.1. Làm giàu và phân lập SRB chịu pH thấp
Làm giàu SRB chịu pH thấp. SRB trong mẫu bùn AMD thu thập đƣợc làm giàu bằng cách cấy vào bình serum chứa mơi trƣờng dịch thể FWS kỵ khí (Bảng 2.1) có pH 5, với tỷ lệ 10%. Bổ sung 2 − 3 chiếc đinh sắt vào bình làm giàu để loại bỏ sulfide hòa tan gây độc cho SRB ở pH thấp, sau đó đặt bình trong tủ ấm 30o
C. Các lần cấy truyền tiếp theo đƣợc tiến hành sau mỗi 5 − 7 ngày ni cấy theo tỷ lệ 10% thể tích. Hoạt tính khử sulfate của SRB trong q trình làm giàu đƣợc xác định thông qua sự xuất hiện kết tủa đen của sulfide kim loại (FeS) và định lƣợng sulfate bị khử.
50
Bảng 2.1. Mơi trƣờng khống nƣớc ngọt FWS (Widdel, Bak, 1992)
Thành phần Hàm lƣợng Nƣớc cất 1 lít Na2SO4 4 g NaCl 1 g MgCl2.6H2O 0,4 g CaCl2.2H2O 0,15 g KCl 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g NH4Cl 0,25 g KH2PO4 0,2 g
Khử trùng môi trƣờng ở 121oC, lấy ra ở 80oC, sục khí N2 trong 5 phút, làm nguội, sau đó bổ sung các chất sau (đã khử trùng riêng) (mL/lít mơi trƣờng):
Hỗn hợp vitamin (bảng 2.2) 1 mL Hỗn hợp vi lƣợng (bảng 2.2) 1 mL Vitamin B1 (Thiamin) 1 mL Vitamin B12 1 mL Na-Lactate 1 M 10 mL Na2S 1M 1 mL NaHCO3 1 M 30 mL
Chỉnh pH đến 7 – 7,2, sau đó san mơi trƣờng sang các bình serum hoặc ống nghiệm rồi sục khí N2/CO2 (90/10 v/v) trong 30 giây, đậy bình và ống nghiệm bằng nút cao su có kẹp nhơm hay nút vặn có lỗ hở, sử dụng ngay hoặc bảo quản trong tối.
Bảng 2.2. Thành phần hỗn hợp vi lƣợng và vitamin (Widdel, Bak, 1992) Hỗn hợp vi lƣợng Hỗn hợp Vitamin (trong đệm phosphate)
Thành phần mg/Lít Thành phần mg/100 mL đệm
HCl 25% (7,7 M) 13 mL Na2HPO4/NaH2PO4 25 mM pH 7,1: 100 mL
FeSO4.7H2O 200 4-Aminobenzoic acid 4
51
MnCl2.4H2O 100 Nicotinic acid (Niacin) 10
CoCl2.6H2O 190 Calcium-D(+)- Pantothenat 5
NiCl2.6H2O 24 Pyridoxin 2 HCl 15
CuCl2.2H2O 2 Lipoic acid 1,5
ZnSO4.7H2O 144 Folic acid 4
Thêm nƣớc cất đến 1000 mL
Phân lập SRB. Mẫu làm giàu lần 4 đƣợc dùng để phân lập SRB. Việc phân lập đƣợc
tiến hành theo phƣơng pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán rắn (1%) với môi trƣờng FWS (Rabus et al., 2006) (Hình 2.1). Các ống thạch bán rắn sau khi bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ các bậc pha loãng khác nhau của mẫu làm giàu đƣợc sục khí N2/CO2 (90/10 v/v) và ủ ở tƣ thế đảo ngƣợc tại 30oC trong bóng tối trong 1 – 2 tuần. Khuẩn lạc đơn lẻ phát triển trong các ống thạch bán rắn có màu đen/xám đƣợc tách bằng pipet Pasteur và chuyển sang các ống nghiệm chứa mơi trƣờng dịch thể. Q trình tinh sạch các khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch bán rắn đƣợc lặp lại 1 – 2 lần cho đến khi thu đƣợc chủng thuần khiết.
Hình 2.1. Các bƣớc phân lập SRB bằng phƣơng pháp ống thạch bán rắn (Nguyễn Thu Hồi,
2015) (1) – Bình làm giàu SRB ở lần cấy truyền thứ 4; (2) – Cấy dịch nuôi (Sau khi pha loãng ở các mức khác nhau) vào ống nghiệm chứa mơi trƣờng khống thạch bán rắn (1%) và hỗn hợp cơ chất, để đông và đuổi oxy bằng sục khí N2; (3) – Đặt ống thạch ở tƣ thế đảo đầu, nuôi tại 30C trong thời gian 1 – 2 tuần; (4) – Tách khuẩn lạc đơn bằng mao quản thủy tinh chế từ pipet Pasteur; (5) − Ống nghiệm có nắp cao su chứa mơi trƣờng dịch thể kỵ khí.
52
2.2.1.2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của SRB
Quan sát đặc điểm hình thái. Tế bào ở pha sinh trƣởng của SRB đƣợc ly tâm cơ đặc 1:20 (thể tích) và đƣa lên lam kính phủ thạch 3% và chụp ảnh trên kính hiển vi phản pha ở độ phóng đại 1000×.
Đánh giá khả năng chịu pH thấp. Các chủng SRB (S4, S10) đƣợc nuôi trƣờng môi
trƣờng dịch thể kỵ khí có sulfate (28 mM) làm chất nhận điện tử và lactate (20 mM) làm chất cho điện tử, pH đƣợc điều chỉnh tới 4, 5, 7. Hoạt tính khử sulfate của SRB đƣợc đánh giá thông qua lƣợng sulfate bị khử sau 15 ngày ni cấy. Thí nghiệm này đƣợc thực hiện nhằm so sánh khả năng chịu pH thấp giữa các chủng phân lập và lựa chọn chủng có đặc tính này tốt nhất.
Tiếp theo, chủng SRB có khả năng chịu pH thấp tốt đƣợc đánh giá về khoảng pH mà chủng có thể khử sulfate, bằng cách nuôi cấy trong môi trƣờng FWS dịch thể kỵ khí có pH khác nhau: pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, và bổ sung một trong hai loại chất cho điện tử là lactate hoặc ethanol (20 mM), nuôi trong tủ ấm 30oC. Hoạt tính khử sulfate của SRB đƣợc đánh giá thông qua xác định nồng độ sulfate bị khử trong môi trƣờng sau 15 ngày nuôi cấy.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ muối. Chủng SRB (S4) đƣợc nuôi trong môi
trƣờng FWS dịch thể kỵ khí có pH 7, ở nhiệt độ 30o
C, có độ muối khác nhau là 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25 g/L. Hoạt tính khử sulfate của SRB đƣợc đánh giá thông qua xác định lƣợng sulfide đƣợc tạo ra và sinh trƣởng của SRB đƣợc đánh giá thông qua sinh khối (OD600) theo thời gian (đƣợc xác định 1 lần/ngày trong 7 ngày).
Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ. Chủng SRB (S4) đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng FWS dịch thể kỵ khí có pH = 7, ở các nhiệt độ: 15oC, 20oC, 25oC, 30oC, 37oC. Lƣợng sulfide đƣợc tạo ra và sinh khối (OD600) đƣợc xác định theo thời gian (đo 1 lần/ngày trong 7 ngày) để đánh giá hoạt tính khử sulfate và sinh trƣởng của SRB.
Nghiên cứu khả năng sử dụng các chất nhận điện tử khác nhau. Chủng SRB (S4) đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng FWS dịch thể kỵ khí có bổ sung lactate (20
53
mM) là chất cho điện tử và một trong các chất nhận điện tử khác nhƣ Ferric-citrate (30 mM), Na-nitrate (5 mM). Dịch nuôi với sulfate (20 mM) là đối chứng dƣơng. Hoạt tính khử sulfate của SRB đƣợc đánh giá thông qua xác định nồng độ các chất nhận điện tử 1 lần/ngày trong 7 ngày.
Khả năng khử đồng thời sulfate và arsenate của SRB đƣợc tiến hành trong môi trƣờng dịch thể kỵ khí có bổ sung sulfate (20 mM) và arsenate (5 mM) làm chất nhận điện tử và lactate (20 mM) làm chất cho điện tử. Hoạt tính khử sulfate và khử arsenate của SRB đƣợc xác định thông qua sự xuất hiện kết tủa màu vàng As2S3, và định lƣợng nồng độ của sulfate và arsenate 1 lần/ngày trong 7 ngày.
Nghiên cứu khả năng sử dụng các chất cho điện tử khác nhau để khử sulfate.
Chủng SRB thuần khiết đƣợc nuôi cấy trong mơi trƣờng FWS dịch thể kỵ khí có bổ sung sulfate (28 mM) làm chất nhận điện tử cuối cùng và một trong các chất cho điện tử là lactate, acetate, methanol, ethanol (20 mM) hoặc dịch cám gạo lên men (phụ lục 1). Riêng cám gạo lên men đƣợc bổ sung với tỷ lệ COD/Sulfate theo lý thuyết là 0,67 (Hao et al., 1994; Neculita, Zagury, 2008). pH của môi trƣờng đƣợc
chỉnh bằng HCl đạt các giá trị 4, 5, 7. Hoạt tính khử sulfate của SRB đƣợc đánh giá qua lƣợng sulfate bị khử sau 15 ngày nuôi cấy.
Đánh giá khả năng chịu kim loại nặng. Chủng SRB (S4, S10) đƣợc nuôi cấy trong
môi trƣờng dịch thể kỵ khí có sulfate (28 mM) làm chất nhận điện tử cuối cùng, lactate (20 mM) làm chất cho điện tử và bổ sung một trong các kim loại nặng thƣờng có mặt ở nồng độ cao trong AMD là Fe2+ (ở nồng độ 60, 200, 400, 800, 2000, 3000 mg/L), Zn2+ (ở nồng độ 20, 50, 70, 100 mg/L), và Cu2+ (ở nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 100 mg/L). Đối chứng là bình ni chủng SRB trong mơi trƣờng tƣơng tự không bổ sung kim loại nặng. Để tránh ảnh hƣởng của kết tủa sulfide kim loại trong môi trƣờng ban đầu, arscorbate (1 mM) đƣợc sử dụng thay thế cho sulfide làm chất khử oxy trong mơi trƣờng ni cấy. Hoạt tính khử sulfate của SRB đƣợc đánh giá thông qua lƣợng sulfate bị khử trong môi trƣờng.
54
Đánh giá vai trị “khởi động” q trình khử sulfate trong mơi trƣờng AMD của chủng SRB chịu pH thấp. Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong AMD nhân tạo có pH
3,5 và các kim loại Fe2+ 380 mg/L, Zn2+ 20 mg/L, Cu2+ 8,3 mg/L, cơ chất lactate 20 mM và sulfate 15 mM. Chủng SRB chịu pH thấp (S4) và một chủng SRB thông thƣờng (SR4H) (khơng có khả năng này) đƣợc ni đồng thời trong các bình serum kín khí chứa AMD nhân tạo. Đối chứng là các bình ni riêng từng chủng ở điều kiện môi trƣờng tƣơng tự. Tác động “cải thiện điều kiện môi trƣờng” của chủng SRB chịu pH thấp đƣợc đánh giá thông qua lƣợng sulfate bị khử và pH trong các bình (ni riêng từng chủng hay ni đồng thời hai chủng) liên tục trong 15 ngày.
2.2.1.3. Bảo quản các chủng SRB
Các chủng SRB đƣợc bảo quản trong phịng thí nghiệm trong glycerol 25% tại 20C sử dụng các mao quản thủy tinh để đảm bảo điều kiện kỵ khí tuyệt đối.
Chủng SRB đƣợc ni trong ống nghiệm kín khí (có nút cao su và nắp xốy nhựa) thể tích 10 ml chứa 5 mL mơi trƣờng khống kỵ khí với Na-lactate (10 mM) là chất cho điện tử và sulfate (28 mM) làm chất nhận điện tử cuối cùng. Sau 5 – 7 ngày khi mật độ quang của dịch ni cao thì thu sinh khối tế bào bằng ly tâm (sử dụng trực tiếp ống nuôi thay cho ống falcon 15 mL) ở 4C trong 15 phút. Loại dịch mơi trƣờng rồi hịa sinh khối trong 1 mL mơi trƣờng khống kỵ khí khơng bổ sung chất cho và nhận điện tử, nhƣng có 25% glycerol.
Hình 2.2. Bảo quản chủng SRB trong các ống mao quản thủy tinh ( = 1 mm) đảm bảo điều
kiện kỵ khí hồn tồn. (A) – Ống mao quản thủy tinh chứa dịch huyền phù tế bào trong glycerol 25%; (B) – Kiểm tra đầu mao quản sau khi đƣợc hàn kín
Bằng dụng cụ trợ hút lấy 0,1 mL dịch huyền phù tế bào vào các mao quản thủy tinh (cách hai đầu mao quản 1 cm mỗi đầu), sau đó hàn kín hai đầu mao quản
55
trên ngọn lửa đèn cồn (Hình 2.2A). Kiểm tra độ kín của mối hàn dƣới kính lúp (Hình 2.2B), sau đó đặt các mao quản ở 4C trong thời gian 2 – 4 giờ rồi chuyển sang điều kiện lạnh sâu 20C. Ở điều kiện này, chủng SRB có thể đƣợc bảo quản duy trì khả năng sinh trƣởng và hoạt tính khử sulfate trong thời gian tới 24 tháng.
2.2.1.4. Xác định số lượng vi khuẩn bằng phương pháp MPN (Most Probable Number)
Mật độ vi sinh vật trong mẫu đƣợc tính dựa theo bảng chỉ số MPN, đơn vị MPN/mL (American Public Health Association, 1989).
Mật độ SRB: Mẫu chứa SRB đƣợc pha lỗng trong mơi trƣờng FWS kỵ khí rồi cấy
vào các ống nghiệm kỵ khí chứa mơi trƣờng FWS (3 ống cho mỗi độ pha loãng). Các ống đƣợc nuôi tĩnh ở 30C và theo dõi lƣợng sulfide sinh ra để xác định sự có mặt của SRB.
Mật độ vi khuẩn khử nitrate: Các bƣớc tiến hành hoàn toàn tƣơng tự nhƣ phƣơng
pháp xác định mật độ SRB. Môi trƣờng FWS đƣợc thay bằng môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn khử nitrate (Phụ lục 3). Các ống MPN đƣợc ghi nhận kết quả là các ống có hiện tƣợng sinh khí N2 và có vi khuẩn sinh trƣởng (quan sát dƣới kính hiển vi).