6. Bố cục đề tài
1.3.6. Phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)
Hình 2.2. Máy sắc ký khí ghép khối phổ (Nguồn: tnic.com.vn)
Phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (viết tắc là GC - MS hoặc GCMS) dựa trên cơ sở mối ghép máy sắc ký khí (gas chromatography) và khối phổ (mass spectrometry). Phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp hai kỹ thuật này các nhà hóa học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lƣợng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, ngƣời ta ứng dụng ký thuật GC – MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành y học, môi trƣờng, nông sản, kiểm nghiệm thục phẩm
Các bộ phận chính của máy khối phổ:
Buồng ion hóa
Bộ phận phân tích tử
Bộ phận tập hợp ion và phóng đại
Bộ phận ghi
* Nguyên lý hoạt động của máy sắc ký khí kết hợp khối phổ
Dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ đƣợc tiêm vào hệ thống tại cửa tiên mẫu. Mẫu sau đó đƣợc dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thƣờng là helium, nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu sẽ đƣợc nâng lên 30000C để mẫu trở thành dạng khí. Phần vỏ ngoài (oven) của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt. Nhiệt độ của lò này dao động từ 40o
C – 3200C. Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt trong đƣợc tráng bằng một loại polimer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp đƣợc phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này.
Sau khi đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ, ở đây chúng bị ion hóa, sau đó tới bộ phận lọc. Dựa trên khối lƣợng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lƣợng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm ứng có nhiệm vụ đếm số lƣợng các hạt có cùng khối lƣợng. Thông tin này sau đó đƣợc chuyển đến máy tính và xuất ra kết quả gọi là phổ khối. Phổ khối là một phổ đồ phản ánh các ion với khối lƣợng khác nhau đi qua bộ phận lọc. Máy tính là bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đƣa ra kết quả khối phổ.
Ta so sánh kết quả khối phổ thu đƣợc trong thí nghiệm với một thƣ viện phổ của các chất đã đƣợc xác định trƣớc. Nếu tìm đƣợc chất tƣơng ứng trong thƣ viện thì ta có thể định danh đƣợc chất đó. Nếu phép so sánh không tìm ra đƣợc kết quả tƣơng ứng, ta thu đƣợc một dữ liệu mới và đóng góp vào thƣ viện cấu trúc sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định đƣợc chính xác loại hợp chất mới này.
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU CHÍNH
- Rễ thầu dầu, thu mẫu vào tháng 8 năm 2014 tại Quận Liên Chiểu - Đà Nẵng.
- Cách lấy mẫu: lấy rễ thầu dầu, rửa sạch, bóc lấy vỏ ngoài, đem phơi khô, nghiền thành bột mịn.
2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ 2.2.1. Hóa chất 2.2.1. Hóa chất
- Hexan: CH3(CH2)4CH3, Trung Quốc - Chloroform: CHCl3, Trung Quốc
- Ethyl acetat: CH3COOC2H5, Trung Quốc - Methanol: CH3OH, Trung Quốc
- HCl, HNO3 (Đức Giang, Việt Nam)
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị - Bộ chiết soxhlet 250 ml - Bộ chiết soxhlet 250 ml - Cốc thủy tinh 50ml, 100ml, 500ml - Bình tam giác có nút nhám 250 ml, 100ml - Pipet 10ml, 50ml - Bình tỉ trọng 50ml
- Chén nung, dao, kẹp sắt, thau, rỗ - Bình cầu, ống sinh hàn
- Cân phân tích, bình hút ẩm - Tủ sấy, lò nung
- Bếp điện, bếp cách thủy
- Máy đo sắc kí khí ghép khối phổ (GC – MS) - Máy đo quang phổ hấp phụ UV – VIS
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS
2.4. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
Hình 2.3. Sơ đồ thực nghiệm Rễ thầu dầu Xử lý mẫu Mẫu nguyên liệu Xác định độ ẩm, hàm lƣợng tro, hàm lƣợng
kim loại AAS Khảo sát các điều
kiện chƣng ninh tối ƣu: nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ rắn/lỏng,
số lần chƣng ninh với dung môi
methanol n- hexan chlorofom Etyl axetat methanol Định danh bằng GC-MS
Cao chiết methanol
Etyl axetat
methanol Cao chiết methanol tổng
chlorofom n- hexan Soxhlet song song Soxhlet nối tiếp
Chiết với các dung môi
cho bay hơi dung môi gộp cao
bằng 2 phƣơng pháp hòa tan bằng nƣớc chiết lỏng lỏng lần lƣợt
Cô đuổi bớt dung môi Chƣng ninh bằng dung môi metanol với điều kiện tối ƣu, lọc
* Thuyết minh qui trình chưng ninh
Rễ sau khi đào về đƣợc rửa sạch, băm nhỏ sau đó phơi khô và xay thành bột mịn để tiến hành nghiên cứu. Một phần bột rễ thầu dầu đƣợc dùng để xác định các chỉ số hóa lí nhƣ: độ ẩm, hàm lƣợng tro, hàm lƣợng hữu cơ, hàm lƣợng kim loại.
Một phần bột rễ thầu dầu đƣợc dùng chƣng ninh với dung môi methanol để khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện đến quá trình chƣng ninh: thời gian, nhiệt độ, tỉ lệ rắn – lỏng, số lần chƣng ninh để quá trình chƣng ninh đạt hiệu quả tối ƣu.
Phần bột còn lại đƣợc dùng để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. Sau khi nghiên cứu tìm ra ảnh hƣởng của các điều kiện đến quá trình chƣng ninh thì tiến hành chƣng ninh với dung môi methanol trong các điều kiện thu đƣợc. Dịch sau khi đƣợc chƣng ninh xong đem cô cạn và tiến hành chiết lỏng – lỏng lần lƣợt với các dung môi theo độ phân cực tăng dần.
2.5. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ CỦA NGUYÊN LIỆU 2.5.1. Xác định độ ẩm [9] 2.5.1. Xác định độ ẩm [9]
- Nguyên tắc
Dùng sức nóng làm bay hơi hết nƣớc trong mẫu. Cân trọng lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy khô, từ đó tính phần trăm nƣớc có trong mẫu.
- Dụng cụ và thiết bị
+ Tủ điều chỉnh nhiệt độ (1000C – 1050C). + Cân phân tích 4 số.
+ Bình hút ẩm phía dƣới để chất hút ẩm (silicagel). + Chén sứ có nắp kín, đũa thủy tinh.
- Cách tiến hành
Cân 5g (chính xác đến 0.0001g) bột rễ cây thầu dầu vào 5 sứ, dùng đũa thủy tinh dàn đều thành lớp mỏng lớp mỏng. Cho tất cả vào tủ sấy ở 100 –
1050C. Sấy khoảng 4h. Sấy xong lấy mẫu ra khỏi tủ, đậy nắp chén, làm nguội trong bình hút ẩm (20 – 25 phút). Cân và ghi lại khối lƣợng.
Cho lại vào tủ sấy 100 – 1050C trong 1h. Lặp lại cho đến khi khối lƣợng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,005g.
- Tính toán kết quả: Độ ẩm phần trăm đƣợc tính theo công thức: ω % = x 100
Trong đó: m0 : trọng lƣợng mẫu trƣớc khi sấy (g) m1 : trọng lƣợng mẫu sau khi sấy (g).
2.5.2. Xác định hàm lƣợng tro [12]
- Nguyên tắc
Phá hủy hợp chất hữu cơ bằng cách nung ở nhiệt độ 5250C 250C đến khối lƣợng không đổi.
- Dụng cụ và thiết bị + Lò nung.
+ Cân phân tích 4 số.
+ Bình hút ẩm phía dƣới để chất hút ẩm (silicagel). + Chén sứ.
- Cách tiến hành
Cân 5g (chính xác đến 0.0001g) bột rễ cây thầu dầu vào 5 chén sứ. Cho tất cả vào lò nung ở nhiệt độ 5250C 250C. Nung trong khoảng 5h. Nung xong lấy mẫu ra khỏi lò, làm nguội trong bình hút ẩm (20 – 25 phút). Cân và ghi lại khối lƣợng.
Cho lại vào lò và nung ở 5250C 250C trong 1h. Lặp lại cho đến khi khối lƣợng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,001g.
H % = x 100% Trong đó :
m1 : khối lƣợng tro
m0 : khối lƣợng bột rễ cây thầu dầu trƣớc khi tro hóa.
2.5.3. Hàm lƣợng kim loại [8]
- Nguyên tắc
Mẫu đƣợc vô cơ hóa và đo trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tắc AAS.
- Dụng cụ và thiết bị
+ Lò nung, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS + Bình định mức, pipet, chén nung…
- Hóa chất
+ Axit nitric đậm đặc. + Axit clohidic.
- Cách tiến hành
Cân khoảng 10g (chính xác đến 0.0001g) bột rễ cây thầu dầu cho vào chén nung. Đặt chén mẫu vào lò nung ở nhiệt độ < 1000C, nâng từ từ nhiệt độ đến 4500C, giữ nhiệt độ này trong khoảng 6-8 giờ.
Lấy chén nung ra khỏi lò nung, làm nguội đến nhiệt độ phòng, nếu tro chƣa chƣa trắng thì thêm vào mẫu 1-2ml dung dịch HNO3 0.1M, đƣa vào lò nung tiếp tục đun đến tro trắng.
Hòa tan cặn bằng 15ml HNO3 0.1M, chuyển mẫu vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch bằng dung dịch HNO3 0.1M. Dung dịch này dùng để đo trên máy AAS.
- Tính toán kết quả
Trong đó:
X : hàm lƣợng kim loại trong mẫu (mg/kg) (µg/kg)
C : hàm lƣợng kim loại đo đƣợc trên thiết bị (mg/L) (µg/L) V : thể tích định mức (ml)
2.6. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHƢNG NINH CHƢNG NINH
2.6.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Cân 6 mẫu, mỗi mẫu cân chính xác khoảng 10 gam bột rễ thầu dầu. Tiến hành chiết chƣng ninh các mẫu này trong cùng một lƣợng dung môi nhất định (100ml metanol) ở các nhiệt độ khác nhau: 400
C, 500C, 600C, 700C, 800C, 900C trong cùng thời gian 100 phút, lọc và thu đƣợc các dịch chiết tƣơng ứng.
Để xác định khối lƣợng chất tan trong dịch chiết ngƣời ta tiến hành nhƣ sau:
- Rửa sạch và sấy khô bình tỉ trọng 50ml, cho dung môi metanol vào bình tỉ trọng, cân thu đƣợc khối lƣợng m0 (gam).
- Cho các dịch chiết vào bình tỉ trọng, cân thu đƣợc khối lƣợng m1
(gam).
- Khối lƣợng chất tan trong dịch chiết đƣợc tính theo công thức: mct = m1 – m0 (gam)
Trong đó:
m0: khối lƣợng bình tỉ trọng và dung môi metanol (gam)
m1: khối lƣợng bình tỉ trọng và dịch chiết trong dung môi metanol (gam)
2.6.2. Ảnh hƣởng của thời gian chiết
Cân 6 mẫu, mỗi mẫu cân chính xác khoảng 10 gam bột rễ thầu dầu. Tiến hành chiết chƣng ninh các mẫu này trong các khoảng thời gian khác
nhau: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ ở 800C trong cùng 100 ml dung môi metanol, lọc và thu đƣợc các dịch chiết tƣơng ứng.
Để xác định khối lƣợng chất tan trong dịch chiết ngƣời ta tiến hành nhƣ sau:
- Rửa sạch và sấy khô bình tỉ trọng 50ml, cho dung môi metanol vào bình tỉ trọng, cân thu đƣợc khối lƣợng m0 (gam).
- Cho các dịch chiết vào bình tỉ trọng, cân thu đƣợc khối lƣợng m1
(gam).
- Khối lƣợng chất tan trong dịch chiết đƣợc tính tƣơng tự nhƣ trên.
2.6.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ rắn(g)/lỏng(ml)
Cân 5 mẫu, mỗi mẫu cân chính xác khoảng 10 gam bột rễ thầu dầu. Tiến hành chiết chƣng ninh các mẫu này trong các lƣợng thể tích dung môi chiết khác nhau: 60ml, 80ml, 100ml, 120ml, 150ml ở 800C trong cùng thời gian 4 giờ, lọc và thu đƣợc các dịch chiết tƣơng ứng.
Để xác định khối lƣợng chất tan trong dịch chiết ngƣời ta tiến hành nhƣ sau:
- Rửa sạch và sấy khô bình tỉ trọng 50ml, cho dung môi methanol vào bình tỉ trọng, cân thu đƣợc khối lƣợng m0 (gam).
- Cho các dịch chiết vào bình tỉ trọng, cân thu đƣợc khối lƣợng m1
(gam).
- Khối lƣợng chất tan trong dịch chiết đƣợc tính tƣơng tự nhƣ công thức trên.
2.6.4. Ảnh hƣởng của số lần chƣng ninh
- Cân chính xác khoảng 10 gam mẫu bột rễ thầu dầu. Tiến hành chiết trong 100 ml dung môi metanol ở 800C trong vòng 4 giờ. Lọc thu đƣợc dịch chiết 1 và bã. Xác định mct1.
- Thu lấy bã, tiến hành chiết lần 2 với 100 ml dung môi metanol ở 800C trong vòng 4 giờ, lọc, thu dịch chiết 2 và bã. Xác định mct2.
- Lặp lại quá trình cho đến khi khối lƣợng chất tan trong dịch chiết hết. - Để xác định khối lƣợng chất tan trong dịch chiết ngƣời ta tiến hành nhƣ sau:
+ Rửa sạch và sấy khô bình tỉ trọng 50ml, cho dung môi metanol vào bình tỉ trọng, cân thu đƣợc khối lƣợng m0 (gam).
+ Cho các dịch chiết vào bình tỉ trọng, cân thu đƣợc khối lƣợng m1
(gam).
mct = m1 – m0 (gam) Trong đó:
m0: khối lƣợng bình tỉ trọng và dung môi metanol (gam)
m1: khối lƣợng bình tỉ trọng và dịch chiết trong dung môi metanol (gam)
- Khối lƣợng chất tan sau n lần chiết chính là tổng khối lƣợng của n lần chiết.
2.7. CHIẾT TÁCH RỄ THẦU DẦU BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHIẾT SOXHLET SOXHLET
Lấy khoảng 10 gam bột rễ thầu dầu, cho vào túi vải, buộc lỏng rồi bỏ vào dụng cụ chiết shoxhlet 250 ml. Tiến hành chiết với dung môi: n-hexan ở 800C. Tiến hành tƣơng tự với dung môi cloroform, etyl axetat và metanol ở các nhiệt độ nhiệt độ tƣơng ứng 750C, 850C, 800C.
Các dịch chiết thu đƣợc đem lọc, đuổi bớt dung môi rồi đem đo phổ GC – MS tại trung tâm đo lƣờng kỹ thuật chất lƣợng kỹ thuật, số 2, Ngô Quyền, Quận 3, TP Đà Nẵng.
Máy đo GC- MS xác định thành phần hóa học dịch chiết của rễ thầu dầu tại trung tâm đo lƣờng kỹ thuật chất lƣợng kỹ thuật, số 2, Ngô Quyền,
Quận 3, TP Đà Nẵng với chƣơng trình chạy nhƣ sau:
+ Thiết bị phân tích: GC/MS 7890A/5975C của hãng Agilent. + Điều kiện chạy máy:
Cột mao quản: DB5-MS (30m-250µm-0,25 µm) Chƣơng trình nhiệt độ buồng cột:
7o/phút 1o/phút 30o/phút 50oC 120oC 165oC 300oC 0 phút 0 phút 0 phút 10 phút Injector: - Khí mang: khí Heli, chế độ chia dòng: Split 10:1. - Nhiệt độ: 280 oC, Áp suất khí mang: 10 psi.
Detector: MS, Chế độ phân tích: Scan Mass (35-600) MS Source: 230 oC
MS Quad: 150 oC
2.8. CHIẾT TÁCH CÁC HỢP CHẤT TRONG RỄ CÂY THẦU DẦU TỪ CAO METHANOL QUA CÁC PHÂN ĐOẠN CHIẾT LỎNG-LỎNG CAO METHANOL QUA CÁC PHÂN ĐOẠN CHIẾT LỎNG-LỎNG
Hình 2.4. Chiết rắn/lỏng bột rễ thầu dầu bằng phương pháp chưng ninh
Cân chính xác khoảng 100g bột rễ thầu dầu, tiến hành chƣng ninh với các điều kiện tối ƣu thu đƣợc ở trên. Sau khi chƣng ninh xong tiến hành lọc
tách riêng dịch chiết và bã. Bã sau khi chƣng ninh lần 1 giữ lại tiến hành chƣng ninh cho đến khi khối lƣợng cặn chiết ra đƣợc ít thì dừng lại.
Cô cạn cao chiết của 3 lần chƣng ninh vào 3 cốc khác nhau và cân khối lƣợng cao.
2.8.1. Chiết lỏng – lỏng bằng các dung môi khác nhau
Cao chiết sau 3 lần chƣng ninh phân tán bằng 100 ml nƣớc cất cho vào bình tam giác có nút nhám và tiến hành chiết lỏng – lỏng với các dung môi theo độ phân cực tăng dần.
Hình 2.5. Chiết lỏng – lỏng bằng Hình 2.6. Chiết lỏng – lỏng bằng dung môi n – hexan dung môi chloroform
2.8.2. Chiết lỏng – lỏng bằng dung môi n – hexan.
Cho tiếp vào bình tam giác có nút nhám ở trên 100ml n-hexan và lắc trong 1h, sau đó cho vào phễu chiết, để lắng trong thời gian 20 phút, dung dịch trong phễu phân bố thành 2 lớp riêng biệt: lớp dƣới là dịch n-hexan, lớp trên là dịch nƣớc (hình 2.3), ta sẽ chiết để lấy phần dƣới còn phần trên cho vào bình tam giác có nút nhám dùng để chiết lần 2 tƣơng tự nhƣ trên chiết liên tục 4 lần thì dịch chiết đƣợc trong suốt thì ngừng chiết, phần dịch nƣớc trong phễu chiết nằm cho vào bình tam giác có nút nhám để chiết với dung môi tiếp theo.
2.8.3. Chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform.
Mỗi lần chiết dùng 50ml dung môi chloroform, lắc trong 1h, tiến hành chiết tƣơng tự nhƣ dung môi n-hexan (Lƣu ý: lớp trên là dịch chloroform, lớp dƣới là dịch nƣớc- hình 2.4), chiết liên tục 3 lần thì dịch chiết đƣợc trong suốt thì ngừng chiết. Dịch nƣớc còn lại tiến hành chiết bằng dung môi tiếp theo
2.8.4. Chiết lỏng – lỏng với dung môi etylaxetat.
Chiết tƣơng tự dung môi n-hexan (50ml etylaxetat, lắc trong 1h), chiết liên tục 9 lần thì dịch chiết đƣợc trong suốt thì ngừng chiết. Dịch nƣớc còn lại