6. Bố cục luận văn
1.3. TỔNG QUAN VỀ CÂY HÚNG QUẾ
1.3.1. Đặc điểm chung của cây húng quế
Giới: Plantac Bộ: Lamiales
Họ: Bạc hà (Lamiaceae). Chi: Ocimum
Loài: O. basilicum
Tên khác: Húng giổi, rau é, é tía, húng chó... Tên vị thuốc: Húng quế [27].
Hình 1.15. Cây húng quế
Húng quế là cây mọc hàng năm, thân thảo, hình vuông, cao khoảng 40 - 50 cm, có khi cao hơn tùy chất đất và khoảng cách trồng, toàn cây có mùi thơm. Thân có mấu, thân non màu xanh có phớt tía hoặc màu tía. Lá đơn mọc đối chéo hình chữ thập. Phiến lá hình trứng nhọn ở đầu và đáy phiến hình nêm men dần xuống cuống, kích thước là 3-8 × 2-5 cm, màu xanh lục, mặt trên đậm hơn mặt dưới, bìa có răng cưa cạn ở 2/3 phía trên, nhiều đốm tuyến. Gân lá hình lông chim nổi rõ ở mặt dưới, có 6-8 cặp gân phụ hơi cong lên ở mép lá. Cuống lá màu xanh nhạt hình trụ hơi phẳng ở mặt trên dài 2-5 cm. Cụm hoa ở ngọn cành kiểu chùm xim bó hoặc chùm xim biến dạng hình tháp. Kiểu chùm xim bó: 2 xim có 6 hoa mọc đối tạo thành vòng giả, khoảng cách giữa hai vòng giả 0,5 - 2 cm, các vòng giả tạo thành chùm dài 10-30 cm. Kiểu chùm xim biến
dạng hình tháp do phía dưới trục hoa phân nhánh phức tạp. Lá bắc chung cho xim 3 hoa, màu xanh tía hoặc tím sẫm, dạng lá nhỏ, kích thước thay đổi nhỏ dần khi càng về phía ngọn của phát hoa, khoảng 0,5 - 1,8 x 0,3 - 1 cm, có lông, cuống ngắn, tồn tại. Hoa nhỏ màu trắng hay hơi tím, không đều lưỡng tính, mọc thành chùm đơn hay phân nhánh với những hoa mọc thành vòng có từ 5 đến 6 hoa. Cuống hoa màu xanh hoặc màu tía, hình trụ nhỏ, dài 0,2 - 0,5 cm, có lông, thường dựng đứng áp vào trục hoa. Quả bế tư, rời nhau, mỗi quả chứa 1 hạt đen, hình trứng ngược, dài khoảng 1,2 mm, khi ngâm vào nước có chất nhầy màu trắng bao quanh. Rễ mọc nông, ăn lan trên mặt đất [29].
Hình 1.16. Hạt và hoa cây húng quế
1.3.2. Phân bố và sinh thái học
Người ta cho rằng cây này vốn nguồn gốc ở Ấn Độ và Trung Quốc, nhưng hiện nay được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và ôn đới thuộc châu Á, châu Âu (như Pháp, Đức, các nước thuộc Liên Xô cũ, Ý, Tây Ban Nha,…). Tại những nước này thường trồng với mục đích như hái lá và toàn cây cất tinh dầu dùng làm thuốc hay trong công nghiệp chất thơm.
Ở nước ta, tại miền Bắc trước đây chỉ thấy trồng lấy lá và ngọn làm gia vị. Từ năm 1975, tại một số tỉnh đã trồng trên quy mô lớn để cất tinh dầu húng quế dùng trong công nghiệp chất thơm ở trong và ngoài nước. Ở miền Nam ngoài mục đích để làm gia vị như ở miền Bắc, người ta còn thu hoạch quả (là hạt để ăn cho mát và giải nhiệt gọi là hột é) [31].
Húng quế có thể trồng được ở các vùng khí hậu của nước ta, trong đó tập trung tại các tỉnh đồng bằng bắc bộ như Hưng Yên, Hải Dương đã trồng với quy mô lớn để phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Nhiệt độ thích hợp đề trồng húng quế từ 25 - 30oC, lượng mưa 1.500 - 1.800 mm. Húng quế là cây ưa ẩm, ưa sáng, thích hợp với đất thoát nước, có nhiều mùn, sinh trưởng quanh năm, tốt nhất là vào mùa hè, về mùa đông cây ra hoa, kết hạt và lụi. Đất thích hợp để trồng húng quế là đất phù sa, giàu dinh dưỡng, các đất khác vẫn trồng được nhưng năng suất, chất lượng kém hơn [33]. Mùa ra hoa tháng 7-9, quả chín tháng 10-12.
1.3.3. Thành phần hóa học
Húng quế chứa nhiều đạm, có khoảng 6% lượng protein, chứa flavonoid với 2 chất orientin và vicenin, nhiều axit amin quan trọng như: Tryptophan, methionine, leucine. Trong tinh dầu có linalol (60%), cineol, estragol metyl- chavicol (25-70%) và nhiều chất khác.
1.3.4. Công dụng
Cây rau húng là một loại thảo dược dùng được trong cả ẩm thực phổ biến trong các món ăn kiểu Ý và châu Á. Cây rau húng cũng là một thành viên của gia đình bạc hà. Rau húng có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới và có mấy giống khác nhau là húng chanh, húng quế... húng quế thường "khỏe" hơn và có thể được trồng như cây lâu năm ở vùng khí hậu ấm hơn. Ngoài hương vị hấp dẫn, húng quế còn có tính chất tăng cường sức khỏe đáng kể.
Có thể kể đến một số công dụng của rau húng quế nói chung như sau: Chống ung thư
Theo một nghiên cứu được công bố trong năm 2010 trên Tạp chí Sản khoa và Phụ Khoa của Đài Loan thì húng quế có thể giúp giảm cholesterol, chống ung thư và tăng cường hệ thống miễn dịch. Một thành phần hóa học
của húng quế, được gọi là axit caffeic, đã được thử nghiệm trong nghiên cứu này, tại Trường Đại học Y Chung Shan, Đài Trung, Đài Loan, và được kết luận là có hiệu quả chống lại ung thư cổ tử cung.
-Tốt cho gan
Một số hợp chất trong húng quế ngọt có thể có thể có tác dụng bảo vệ gan, theo một nghiên cứu tiến hành tại Đại học Mansoura, Ai Cập. Trong một nghiên cứu khác, các nhà khoa học lấy 6 hợp chất trong rau húng quế được trích xuất và thử nghiệm khả năng bảo vệ chống lại căng thẳng oxy hóa gan. Kết quả là, tất cả các hợp chất này đều có tác dụng bảo vệ gan.
- Ổn định lượng đường trong máu
Các nhà nghiên cứu đã báo cáo của một nghiên cứu được tiến hành tại Trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ, Kanpur, Ấn Độ rằng các chất được chiết xuất từ lá húng quế ngọt sẽ làm giảm lượng đường trong máu. Trong nghiên cứu, được công bố trong năm 1996 trên một tạp chí Y dược, người ta thấy, những người tham gia tiêu thụ lá húng quế sẽ giảm 17% tình trạng giảm đường huyết lúc đói và giảm 7% lượng đường trong máu ngay lập tức sau bữa ăn. Tương tự, nồng độ đường trong nước tiểu cũng được cải thiện đáng kể. Các tác giả kết luận rằng húng quế có thể có một vị trí quan trọng trong điều trị bệnh tiểu đường từ nhẹ đến vừa.
- Kháng khuẩn
Đặc tính chống vi khuẩn của rau húng nói chung là hữu ích trong việc ngăn ngừa các bệnh truyền qua thực phẩm - theo một nghiên cứu tiến hành tại Trung tâm Năng lượng nguyên tử, Ramna, Dhaka, Bangladesh. Trong một nghiên cứu về sinh dược phẩm, được công bố trong năm 2010 thì hơn 50 hợp chất được phân lập từ lá và thân cây húng quế ngọt ngào và thử nghiệm trên nhiều loại vi khuẩn gây bệnh bao gồm Staphylococcus aureus, Escherichia coli, S. dysenteriae và Salmonella typhi. Sau quá trình quan sát, các nhà
nghiên cứu kết luận rằng húng quế có thể chống lại các vi khuẩn gây bệnh nói trên, do đó, nó có thể được sử dụng như một tác nhân chống vi khuẩn trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.
Ngoài các công dụng trên, các loại rau húng nói chung còn có tác dụng chống ôxy hóa, bảo vệ tế bào cơ tim, chống lại các thiệt hại do ôxy hóa. Tinh dầu trong rau húng đã được thử nghiệm có thể hòa tan trong nước và có lợi cho các hoạt động sinh học bên trong cơ thể [32].
1.4. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS [1] 1.4.1. Phân loại khoa học 1.4.1. Phân loại khoa học
Bộ : Eubacteriales
Họ : Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus
Hình 1.17. Vi khuẩn Bacillus subtilis nhìn dưới kính hiển vi điện tử
1.4.2. Đặc điểm
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 – 0,8 µm × 1,5 - 3 µm, đứng đơn lẻ hoặc hình thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng axit, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ.
bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào B. Subtilis.
1.4.3. Tính chất nuôi cấy
Đặc điểm phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 370C.
Nhu cầu O2: B. Subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.
Độ pH: B. Subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4.
Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tẩm sẵn màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu
- Lá húng quế, được mua tại chợ Hòa Khánh, thành phố Đà Nẵng.
- Chọn lá húng quế tươi, xanh, không bị sâu mọt, không bị dập, úng. Làm sạch lá, để khô rồi cắt nhỏ.
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất
a. Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ: bình tam giác có nút nhám 100 ml, cốc thủy tinh 250 ml, pipet 2 ml, 5ml, 10 ml, 50 m, , phễu chiết, nhiệt kế, chén sứ 5 cái, bình định mức 50 ml, 100 ml, giấy lọc.
- Các thiết bị: bếp điện, cân phân tích, tủ sấy, lò nung, bình hút ẩm, máy cô chân không, máy khuấy từ, máy đo pH, máy đo phổ UV-VIS, máy đo EDX, XRD, TEM.
- Buồng cấy vô trùng, nồi hấp tiệt trùng, tủ ấm, que tra, đĩa peptry, giấy bạc, que cấy.
b. Hóa chất
- Bạc nitrat (AgNO3) - Natrihiđroxit (NaOH) - Axit axetic (CH3COOH) - Axit clohiđric (HCl) - Sắt (III) clorua (FeCl3) - Axit sunfuric (H2SO4)
- Chì axetat (Pb(COO)2.3H2O) - Amoniac (NH3)
- Pepton - Cồn 960 - Thạc agar - Cao nấm men - Natri clorua (NaCl)
Các hóa chất trên đều có xuất xứ từ Trung Quốc và mức độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn.
2.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 2.2.1. Xác định độ ẩm 2.2.1. Xác định độ ẩm
Nguyên tắc: Sấy nguyên liệu ở 800C đến khối lượng không đổi.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị sẵn 5 chén sứ sạch, đánh dấu và sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C. Sau khi sấy xong, đặt chén vào bình hút ẩm, để nguội ở nhiệt độ phòng, cân các chén sứ ta được khối lượng m1 (g).
Cho vào mỗi chén sứ khoảng 2 gam mẫu lá húng quế tươi. Sau đó tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C, cứ sau 2 giờ lấy ra cân, cứ như vậy đến khi khối lượng m2 của mẫu và chén không đổi thì cho vào bình hút ẩm để làm nguội.
Tính kết quả: Nguyên liệu ẩm có thể xem như hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và nước tự do: m = m0 + w.
Độ ẩm tương đối ω của nguyên liệu ẩm: là tỷ số giữa khối lượng nước trên khối lượng chung m (g) của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm:
ω = .100 = .100 = .100 Trong đó:
m: khối lượng của mẫu nguyên liệu (g) m0: khối lượng của chất khô tuyệt đối (g)
m1: khối lượng chén sứ (g)
m2:khối lượng nguyên liệu và chén sứ sau khi sấy (g) Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
2.2.2. Xác định hàm lượng tro
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc đốt chất hữu cơ ở nhiệt độ cao trong lò nung. Phương pháp này đơn giản, nhanh được áp dụng trong phòng thí nghiệm.
Cách tiến hành:
- Từ 5 mẫu lá húng quế đã được xác định độ ẩm trên, đem than hóa sơ bộ, sau đó cho vào lò nung tro hóa ở nhiệt độ 500- 550oC trong khoảng 3h đến khi tro có màu trắng.
- Lấy ra, để nguội trong bình hút ẩm và cân (m3) để xác định hàm lượng tro. Hàm lượng tro:
T(%) = .100% Trong đó:
m1: khối lượng chén sứ (g)
m3: khối lượng nguyên liệu và chén sứ sau khi tro hóa (g) m: khối lượng của mẫu nguyên liệu
T% là hàm lượng tro.
Hàm lượng tro của lá húng quế là hàm lượng tro trung bình của 5 mẫu.
2.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT LÁ HÚNG QUẾ CHIẾT LÁ HÚNG QUẾ
2.3.1. Khảo sát thời gian chiết
Để khảo sát thời gian chiết tối ưu nhằm thu được dịch chiết lá húng quế tối ưu cho quá trình điều chế nano bạc thì ta sẽ cố định các thông số như sau:
-Tỉ lệ rắn/ lỏng: 15g lá húng quế / 200 ml nước cất. -Nồng độ dung dịch AgNO3: 0,5 mM.
-Tỉ lệ thể tích dung dịch AgNO3 / thể tích dịch chiết: 30ml / 2ml. -Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ phòng.
-Môi trường pH: pH = 6,20 của chính hỗn hợp dung dịch phản ứng. -Thời gian tạo nano: 30 phút.
-Đối với thông số thời gian chiết, các giá trị biến thiên: t = 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút.
2.3.2. Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng
- Điều kiện khảo sát như mục 2.3.1.
- Thời gian chiết: t (thời gian tối ưu đã chọn theo mục 2.3.1).
- Đối với thông số tỉ lệ rắn lỏng, cố định thể tích nước, còn giá trị khối lượng mẫu lá húng quế biến thiên: m = 5 gam, 10 gam, 15 gam, 20 gam, 25 gam.
2.4. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT HÓA HỌC TRONG DỊCH CHIẾT LÁ HÚNG QUẾ CHIẾT LÁ HÚNG QUẾ
Sau khi đã chọn được thời gian chiết và tỉ lệ rắn/lỏng tối ưu, tiến hành chiết mẫu lá húng quế với các thông số cố định để thu được dịch chiết lá húng quế tối ưu. Sau đó tiến hành định tính các nhóm chất có trong lá húng quế.
2.4.1. Định tính nhóm chất tanin
Tanin là những hợp chất tự nhiên thuộc nhóm polyphenol phổ biến trong thực vật. Chúng có vị chát, có tính thuộc da. Có nghĩa là có khả năng liên kết với protein của da tạo thành cấu trúc bền vững với quá tŕnh thối rữa. Tanin có thể chia thành hai loại chính: tanin thủy phân được và tanin ngưng tụ
Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 ống nghiệm sạch
- Ống nghiệm 1: lấy 2 ml dịch chiết, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3.
- Ống nghiệm 2: lấy 2 ml dịch chiết, thêm 2 giọt dung dịch chì axetat (Pb(CH3COO)2)10%.
- Ống nghiệm 3: lấy 10 ml dịch chiết, thêm 2 ml fomon và 1 ml HCl đậm đặc. Nếu thấy xuất hiện kết tủa thì lọc bỏ kết tủa, thêm vào dịch lọc natri axetat dư, rồi thêm 2 giọt dung dịch FeCl3.
2.4.2. Định tính nhóm chất flavonoid
Flavonoid là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay noi cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon. Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu. Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo pH của môi trường.
Cách tiến hành: Chuẩn bị một ống nghiệm sạch và một lọ chứa dung dịch amoniac đặc.
- Ống nghiệm 1: lấy 2 ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại, nhỏ từng giọt dung dịch HCl đặc, để yên 1-2 phút.
- Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút. Quan sát màu vết dịch chiết.
2.4.3. Định tính nhóm chất saponin
Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. saponin có một số tính chất đặc biệt. Dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia ra: saponin trierpenoid và saponin steroid.
Cách tiến hành: Chuẩn bị hai ống nghiệm sạch.
- Ống nghiệm 1: lấy 3 ml dịch chiết, lắc mạnh trong 2 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt.
- Ống nghiệm 2: lấy 2 ml dịch chiết, nhỏ thêm 3 giọt H2SO4 đậm đặc.