6. Bố cục luận văn
1.4. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
1.4.1. Phân loại khoa học
Bộ : Eubacteriales
Họ : Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus
Hình 1.17. Vi khuẩn Bacillus subtilis nhìn dưới kính hiển vi điện tử
1.4.2. Đặc điểm
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 – 0,8 µm × 1,5 - 3 µm, đứng đơn lẻ hoặc hình thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng axit, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ.
bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào B. Subtilis.
1.4.3. Tính chất nuôi cấy
Đặc điểm phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 370C.
Nhu cầu O2: B. Subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.
Độ pH: B. Subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4.
Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tẩm sẵn màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu
- Lá húng quế, được mua tại chợ Hòa Khánh, thành phố Đà Nẵng.
- Chọn lá húng quế tươi, xanh, không bị sâu mọt, không bị dập, úng. Làm sạch lá, để khô rồi cắt nhỏ.
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất
a. Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ: bình tam giác có nút nhám 100 ml, cốc thủy tinh 250 ml, pipet 2 ml, 5ml, 10 ml, 50 m, , phễu chiết, nhiệt kế, chén sứ 5 cái, bình định mức 50 ml, 100 ml, giấy lọc.
- Các thiết bị: bếp điện, cân phân tích, tủ sấy, lò nung, bình hút ẩm, máy cô chân không, máy khuấy từ, máy đo pH, máy đo phổ UV-VIS, máy đo EDX, XRD, TEM.
- Buồng cấy vô trùng, nồi hấp tiệt trùng, tủ ấm, que tra, đĩa peptry, giấy bạc, que cấy.
b. Hóa chất
- Bạc nitrat (AgNO3) - Natrihiđroxit (NaOH) - Axit axetic (CH3COOH) - Axit clohiđric (HCl) - Sắt (III) clorua (FeCl3) - Axit sunfuric (H2SO4)
- Chì axetat (Pb(COO)2.3H2O) - Amoniac (NH3)
- Pepton - Cồn 960 - Thạc agar - Cao nấm men - Natri clorua (NaCl)
Các hóa chất trên đều có xuất xứ từ Trung Quốc và mức độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn.
2.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 2.2.1. Xác định độ ẩm 2.2.1. Xác định độ ẩm
Nguyên tắc: Sấy nguyên liệu ở 800C đến khối lượng không đổi.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị sẵn 5 chén sứ sạch, đánh dấu và sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C. Sau khi sấy xong, đặt chén vào bình hút ẩm, để nguội ở nhiệt độ phòng, cân các chén sứ ta được khối lượng m1 (g).
Cho vào mỗi chén sứ khoảng 2 gam mẫu lá húng quế tươi. Sau đó tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C, cứ sau 2 giờ lấy ra cân, cứ như vậy đến khi khối lượng m2 của mẫu và chén không đổi thì cho vào bình hút ẩm để làm nguội.
Tính kết quả: Nguyên liệu ẩm có thể xem như hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và nước tự do: m = m0 + w.
Độ ẩm tương đối ω của nguyên liệu ẩm: là tỷ số giữa khối lượng nước trên khối lượng chung m (g) của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm:
ω = .100 = .100 = .100 Trong đó:
m: khối lượng của mẫu nguyên liệu (g) m0: khối lượng của chất khô tuyệt đối (g)
m1: khối lượng chén sứ (g)
m2:khối lượng nguyên liệu và chén sứ sau khi sấy (g) Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
2.2.2. Xác định hàm lượng tro
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc đốt chất hữu cơ ở nhiệt độ cao trong lò nung. Phương pháp này đơn giản, nhanh được áp dụng trong phòng thí nghiệm.
Cách tiến hành:
- Từ 5 mẫu lá húng quế đã được xác định độ ẩm trên, đem than hóa sơ bộ, sau đó cho vào lò nung tro hóa ở nhiệt độ 500- 550oC trong khoảng 3h đến khi tro có màu trắng.
- Lấy ra, để nguội trong bình hút ẩm và cân (m3) để xác định hàm lượng tro. Hàm lượng tro:
T(%) = .100% Trong đó:
m1: khối lượng chén sứ (g)
m3: khối lượng nguyên liệu và chén sứ sau khi tro hóa (g) m: khối lượng của mẫu nguyên liệu
T% là hàm lượng tro.
Hàm lượng tro của lá húng quế là hàm lượng tro trung bình của 5 mẫu.
2.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT LÁ HÚNG QUẾ CHIẾT LÁ HÚNG QUẾ
2.3.1. Khảo sát thời gian chiết
Để khảo sát thời gian chiết tối ưu nhằm thu được dịch chiết lá húng quế tối ưu cho quá trình điều chế nano bạc thì ta sẽ cố định các thông số như sau:
-Tỉ lệ rắn/ lỏng: 15g lá húng quế / 200 ml nước cất. -Nồng độ dung dịch AgNO3: 0,5 mM.
-Tỉ lệ thể tích dung dịch AgNO3 / thể tích dịch chiết: 30ml / 2ml. -Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ phòng.
-Môi trường pH: pH = 6,20 của chính hỗn hợp dung dịch phản ứng. -Thời gian tạo nano: 30 phút.
-Đối với thông số thời gian chiết, các giá trị biến thiên: t = 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút.
2.3.2. Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng
- Điều kiện khảo sát như mục 2.3.1.
- Thời gian chiết: t (thời gian tối ưu đã chọn theo mục 2.3.1).
- Đối với thông số tỉ lệ rắn lỏng, cố định thể tích nước, còn giá trị khối lượng mẫu lá húng quế biến thiên: m = 5 gam, 10 gam, 15 gam, 20 gam, 25 gam.
2.4. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT HÓA HỌC TRONG DỊCH CHIẾT LÁ HÚNG QUẾ CHIẾT LÁ HÚNG QUẾ
Sau khi đã chọn được thời gian chiết và tỉ lệ rắn/lỏng tối ưu, tiến hành chiết mẫu lá húng quế với các thông số cố định để thu được dịch chiết lá húng quế tối ưu. Sau đó tiến hành định tính các nhóm chất có trong lá húng quế.
2.4.1. Định tính nhóm chất tanin
Tanin là những hợp chất tự nhiên thuộc nhóm polyphenol phổ biến trong thực vật. Chúng có vị chát, có tính thuộc da. Có nghĩa là có khả năng liên kết với protein của da tạo thành cấu trúc bền vững với quá tŕnh thối rữa. Tanin có thể chia thành hai loại chính: tanin thủy phân được và tanin ngưng tụ
Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 ống nghiệm sạch
- Ống nghiệm 1: lấy 2 ml dịch chiết, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3.
- Ống nghiệm 2: lấy 2 ml dịch chiết, thêm 2 giọt dung dịch chì axetat (Pb(CH3COO)2)10%.
- Ống nghiệm 3: lấy 10 ml dịch chiết, thêm 2 ml fomon và 1 ml HCl đậm đặc. Nếu thấy xuất hiện kết tủa thì lọc bỏ kết tủa, thêm vào dịch lọc natri axetat dư, rồi thêm 2 giọt dung dịch FeCl3.
2.4.2. Định tính nhóm chất flavonoid
Flavonoid là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay noi cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon. Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu. Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo pH của môi trường.
Cách tiến hành: Chuẩn bị một ống nghiệm sạch và một lọ chứa dung dịch amoniac đặc.
- Ống nghiệm 1: lấy 2 ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại, nhỏ từng giọt dung dịch HCl đặc, để yên 1-2 phút.
- Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút. Quan sát màu vết dịch chiết.
2.4.3. Định tính nhóm chất saponin
Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. saponin có một số tính chất đặc biệt. Dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia ra: saponin trierpenoid và saponin steroid.
Cách tiến hành: Chuẩn bị hai ống nghiệm sạch.
- Ống nghiệm 1: lấy 3 ml dịch chiết, lắc mạnh trong 2 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt.
- Ống nghiệm 2: lấy 2 ml dịch chiết, nhỏ thêm 3 giọt H2SO4 đậm đặc.
2.4.4. Định tính nhóm chất alkaloid
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, thường có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược lực tính mạnh.
Cách tiến hành: Chuẩn bị một ống nghiệm sạch. Lấy 2 ml dịch chiết, thêm vào thuốc thử Bouchardat, quan sát ống nghiệm.
2.5. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TẠO NANO BẠC NANO BẠC
Sau khi đã thu được dịch chiết lá húng quế tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát lần lượt các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo nano bạc.
2.5.1. Khảo sát nồng độ dung dịch bạc nitrat
Để khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dung dịch bạc nitrat đến khả năng tạo nano bạc và xác định nồng độ bạc nitrat tối ưu, chúng tôi tiến hành cố định các thông số như sau:
- Thời gian tạo nano bạc: 30 phút
- Nhiệt độ tạo nano bạc : nhiệt độ phòng - Thể tích dịch chiết : 2ml
- Thể tích dung dịch AgNO3: 30ml - Môi trường pH = 6,20
- Nồng độ dung dịch AgNO3 biến thiên: 0,5 mM; 1mM; 2mM; 3mM; 4mM; 5mM.
2.5.2. Khảo sát thể tích dịch chiết lá húng quế
- Điều kiện khảo sát như mục 2.5.1.
- Nồng độ dung dịch bạc nitrat được chọn ở mục 2.5.1. - Thể tích dịch chiết biến thiên: 1ml; 2ml; 3ml; 4ml; 5ml.
2.5.3. Khảo sát nhiệt độ tạo nano bạc
- Điều kiện khảo sát như mục 2.5.2.
- Thể tích dịch chiết lá húng quế được chọn ở mục 2.5.2.
- Nhiệt độ tạo nano bạc biến thiên: 200C; 300C; 400C; 500C; 600C; 700C.
2.5.4. Khảo sát pH môi trường tạo nano bạc
- Điều kiện khảo sát như mục 2.5.3.
- Nhiệt độ tạo nano bạc được chọn ở mục 2.5.3.
2.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HẠT NANO BẠC
Để tạo được nano bạc tối ưu và xác định kích thước, hình dạng, số lượng nano bạc tạo thành, chúng tôi nghiên cứu dung dịch nano bạc bằng các phương pháp phổ UV-VIS, TEM, EDX, và XRD.
2.6.1. Phương pháp phổ tử ngoại và phổ khả kiến (UV-VIS)
UV-VIS (Ultraviolet–visible spectroscopy) là phương pháp phân tích sử dụng phổ hấp thụ hoặc phản xạ trong phạm vi vùng cực tím cho tới vùng ánh sáng nhìn thấy được.
Do các thuộc tính quang học của dung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định các thuộc tính trên.
Do hạt nao bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặt plasmon duy nhất nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất. Người ta xử dụng tính chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc [34].
Hình 2.2. Máy UV-VIS LAMBDA 25 của hãng PerkinElmer
2.6.2. Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmisson Electron Microscope – TEM) [2] Microscope – TEM) [2]
Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) là phương pháp cho phép sử dụng chùm tia electron năng lượng cao để quan sát các vật thể rất nhỏ. Độ phóng đại của TEM là 400.000 lần đối với nhiều vật liệu và thậm chí lên đến 15 triệu lần đối với các nguyên tử. Với ưu thế về độ phóng đại rất lớn, TEM là công cụ đặc biệt quan trọng trong việc nghiên cứu các vật liệu nano.
Hình 2.3. Sơđồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi điện tử truyền qua TEM.
Nguyên lý làm việc của máy TEM được mô tả như sau: Chùm electron được tạo ra từ nguồn sau khi đi qua các thấu kính hội tụ sẽ tập trung lại tạo thành một dòng electron hẹp. Dòng electron này tương tác với mẫu và một phần xuyên qua mẫu. Phần truyền qua đó được hội tụ bằng một thấu kính và tạo ảnh. Ảnh sau đó sẽ được truyền đến bộ phận phóng đại. Cuối cùng tín hiệu tương tác với màn huỳnh quang và sinh ra ánh sáng cho phép người dùng quan sát được ảnh. Phần tối của ảnh đại diện cho vùng mẫu đã cản trở, chỉ cho một số ít electron xuyên qua (vùng mẫu dày hoặc có mật độ cao). Phần sáng của ảnh đại diện cho những vùng mẫu không cản trở, cho nhiều electron truyền qua (vùng này mỏng hoặc có mật độ thấp). Ảnh TEM thu được sẽ là hình ảnh mặt cắt ngang của vật thể. Ảnh TEM có thể cung cấp thông tin về hình dạng, cấu trúc kích thước của vật liệu nano.
Nguồn cấp Thấu kính hội tụ Mẫu Phóng ảnh to Ảnh Màn hình hiển thị
Hình 2.4. Kính hiển vi điện tử truyền qua
2.6.3. Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) [3]
Phổ tán xạ năng lượng tia X, hay Phổ tán sắc năng lượng là kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn do tương tác với các bức xạ (mà chủ yếu là chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử). Trong các tài liệu khoa học, kỹ thuật này thường được viết tắt là EDX hay EDS xuất phát từ tên gọi tiếng Anh Energy-dispersive X-ray spectroscopy.
Nguyên tắc hoạt động
Kỹ thuật EDX chủ yếu được thực hiện trong các kính hiển vi điện tử, ở đó ảnh vi cấu trúc vật rắn được ghi lại thông qua việc sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao tương tác với vật rắn. Khi chùm điện tử có năng lượng lớn được chiếu vào vật rắn, nó sẽ đâm xuyên sâu vào nguyên tử vật rắn và tương tác với các lớp điện tử bên trong của nguyên tử.
Bán kính nguyên tử Electron bật ra Sự kích thích ngoại Năng lượng phát xạ Hình 2.5. Ảnh mô hình tán xạ tia X
Tương tác này dẫn đến việc tạo ra các tia X có bước sóng đặc trưng tỉ lệ với nguyên tử số (Z) của nguyên tử theo định luật Mosley:
Có nghĩa là: tần số tia X phát ra là đặc trưng với nguyên tử của mỗi chất có mặt trong chất rắn. Việc ghi nhận phổ tia X phát ra từ vật rắn sẽ cho thông tin về các nguyên tố hóa học có mặt trong mẫu đồng thời cho các thông tin về tỉ phần các nguyên tố này (xem chi tiết về cơ chế tạo tia X).
Có nhiều thiết bị phân tích EDX nhưng chủ yếu EDX được phát triển trong các kính hiển vi điện tử, ở đó các phép phân tích được thực hiện nhờ các chùm điện tử có năng lượng cao và được thu hẹp nhờ hệ các thấu kính điện từ. Phổ tia X phát ra sẽ có tần số (năng lượng photon tia X) trải trong một vùng rộng và được phân tích nhờ phổ kế tán sắc năng lượng do đó ghi nhận thông tin về các nguyên tố cũng như thành phần. Kỹ thuật EDX được phát triển từ những năm 1960s và thiết bị thương phẩm xuất hiện vào đầu những năm 1970s với việc sử dụng detector dịch chuyển Si, Li hoặc Ge.
Hình 2.6. Máy phân tích thành phần kim loại EDX-100A
2.6.4. Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) [11], [13]
Nhiễu xạ là đặc tính chung của các sóng bị thay đổi khi tương tác với vật chất và là sự giao thoa tăng cường của nhiều hơn một sóng tán xạ.
Mỗi photon có năng lượng E tỷ lệ với tần số của nó:
u * = h E hoặc E c h = l Trong đó:
h - hằng số Plank, h = 4,136. 10-15 e5.s hay 6,626.10-34 J.s. c – tốc độ ánh sáng c = 2,998. 108 m/s.