1.4.1. Các khái niệm cơ bản về quá trình chiết
Chiết là quá trình chuyển chất cần chiết rút trong nguyên liệu vào dung môi và được thực hiện bằng khuếch tán phân tử và khuếch tán đối lưu [1].
a. Khuếch tán phân tử
Là sự chuyển vật chất cần chiết rút từ pha này sang pha khác do sự chuyển động nhiệt hỗn loạn trong môi trường tĩnh.
Khuếch tán phân tửtheo định luật Fick I: = DS Trong đó:
dm
dt : tốc độ hòa tan chất cần chiết
dC
dt : gradient nồng độ
D: hệ số khuếch tán phân tử, phụ thuộc vào nhiệt độ (T), độ nhớt của dung môi và bán kính phân tử chất cần chiết (r) theo công thức Einstein:
D = k.T 6. .r.ME (k: hằng số Boltzmann)
Như vậy, tốc độ khuếch tán phân tử càng mạnh khi chênh lệch nồng độ chất cần chiết giữa 2 pha tiếp xúc nhau, diện tích bề mặt tiếp xúc giữ nguyên liệu và dung môi càng lớn, nhiệt độcàng cao và kích thước phân tử chất cần chiết càng nhỏ.
b. Khuếch tán đối lưu
Là sự vận chuyển vật chất từmôi trường này sang môi trường khác trong dòng chuyển động của chất lỏng ở chếđộ chảy xoáy. Khuếch tán đối lưu là Hình thái di chuyển vật chất trong dung dịch ở phạm vi nhỏ.
Khuếch tán đối lưu theo định luật Sucarep:
dt dm
= B.S.dC
Trong đó:
dm, dt, dC và S có ý nghĩa giống như công thức khuếch tán phân tửở trên. B: hằng số tốc độ khuếch tán đối lưu.
Trong khuếch tán phân tử sự di chuyển vật chất nhờ vào động năng của chuyển động nhiệt phân tử. Trong khuếch tán đối lưu di chuyển vật chất nhờ vào năng lượng bên ngoài dẫn tới. Khuếch tán phân tử và khuếch tán đối lưu được gọi là khuếch tán nồng độ vì động lực của quá trình khuếch tán đều là do chênh lệch nồng độ.
1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết
Trong quá trình chiết, đểđạt được vận tốc chiết và hiệu suất chiết cao, cần lưu ý các yếu tố sau [2]:
Chênh lệch nồng độ chất cần chiết ở trong nguyên liệu và dung môi phải cao để quá trình khuếch tán các phân tử cần chiết càng mạnh.
Muốn vậy, có thể lợi dụng nguyên lý chiết ngược dòng để tạo ra sự chênh lệch nồng độ lớn (trong chiết liên tục) hay thay mới dung môi chiết nhiều lần (trong chiết gián đoạn).
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu phải đủ lớn. Tuy nhiên chỉ lớn ở mức độ hợp lý nhất định: nếu tỷ lệ này quá lớn sẽ làm cho nồng độ chất cần chiết trong dung dịch chiết rút đuợc thấp, gây khó khăn và hiệu quả kinh tế kém (tốn năng lượng và thời gian đuổi dung môi)
Hình thái, tính chất và cấu tạo của tổ chức nguyên liệu:
- Mức độ phá vỡ cấu trúc tế bào càng nhiều thì sự tiếp xúc giữa chất cần chiết và dung môi càng tăng nên rút ngắn thời gian chiết và chiết triệt đểhơn.
- Kích thước càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi càng tăng, hiệu suất chiết tăng. Tuy nhiên cũng chỉ nên nhỏ tới mức nhất định vì quá nhỏ nguyên liệu dễ bị vón lại các hạt mịn lắng đọng trên các lớp nguyên liệu. Mặt khác, nguyên liệu quá nhỏ sẽ bị cuốn vào dịch chiết gây khó khăn cho quá trình xử lý dịch chiết sau khi chiết.
- Tính chất của nguyên liệu cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết. Khi chiết bằng dung môi hữu cơ, độẩm nguyên liệu giảm thì tốc độ chiết tăng lên.
Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết
- Thời gian càng dài thì lượng chất khuếch tán tăng, nhưng thời gian phải có giới hạn. Khi đạt được mức độ trích ly cao nhất nếu kéo dài thời gian thì sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế.
- Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, do đó phân tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phân tử dung môi. Tuy nhiên, nhiệt độtăng có giới hạn, vì nhiệt độ quá cao sẽ có thể phân hủy phân tử cần chiết và gây khó khăn cho quá trình công nghệ.
Dung môi chiết
Dung môi chiết cần thỏa mãn các điều kiện sau: - Hòa tan chất cần chiết ở bất kì tỷ lệ nào.
- Có thành phần hóa học ổn định, không phản ứng phụ với nguyên liệu. - Không độc hại, không ảnh hưởng sức khỏe và chất lượng sản phẩm. - Khó cháy nổ, an toàn cho quá trình sản xuất.
- Không ăn mòn thiết bị.
- Rẻ tiền, dễ kiếm, có khảnăng sử dụng trong sản xuất.
Tuy nhiên hiện nay chưa có loại dung môi nào đáp ứng đầy đủ những điều kiện trên. Do đó, tùy trường hợp chiết cụ thểđể chọn dung môi cho hợp lý.
1.4.3. Các phương pháp chiết
Dựa vào cách tiến hành, có thểchia thành các phương pháp chiết sau:
a. Chiết gián đoạn
Theo phương pháp này ta ngâm nguyên liệu vào dung môi. Sau một thời gian nhất định, khi giữa dung môi và nguyên liệu đạt nồng độ chất cần thiết ở mức độ cân bằng, tiến hành đổ dung môi cũ ra, thay dung môi mới vào. Cứnhư thếcho đến khi chiết hết chất cần chiết. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện. Nhược điểm là tốn công, tốn thời gian cũng như tốn dung môi chiết nên không kinh tế, không phù hợp với quy mô sản xuất lớn.
b. Chiết bán liên tục
Nguyên lý của phương pháp này là dùng nhiều thiết bị chiết gián đoạn bố trí thành một hệ thống liên hợp tuần hoàn nhằm mục đích giảm thời gian chiết, ít tốn công hơn, tiết kiệm được nhiều dung môi hơn. Đối với phương pháp này quá trình chiết thực hiện theo nguyên tắc dung môi đi từ nơi có nồng độ chất chiết cao đến nồng độ chất chiết thấp.
c. Chiết liên tục
Nguyên lý là ngâm dung môi trong dòng chuyển động cùng chiều hay ngược chiều của dung môi. Ưu điểm của phương pháp này là cho hiệu quả kinh tế cao, thích hợp cho sản xuất công suất lớn, áp dụng cho quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, nhược điểm là thiết bị khá phức tạp, chi phí đầu tư lớn.
1.4.4. Một số kỹ thuật chiết hiện đại dùng để chiết xuất chất màu tự nhiên
a. Chiết nhờ siêu âm (Ultrasound-assisted extraction)
Nguyên liệu được trộn với dung môi thích hợp rồi chiết bằng siêu âm. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng siêu âm có khảnăng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, do đó giúp cho xâm nhập của dung môi vào bên trong tế bào dễdàng hơn. Ngoài ra, siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi, do đó gia tăng sự tiếp xúc của dung môi với chất cần chiết và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết.
b. Chiết siêu tới hạn (SFE: Supercritical Fluid Extraction)
Đây là phương pháp chiết được quan tâm nhiều nhất hiện nay trong lĩnh vực chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu tự nhiên nhằm ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm. Phương pháp này cho phép tự động hóa quá trình chiết và hạn chế việc sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại. Dung môi chiết là một chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn. Ở trạng thái này, chất lỏng có những tính chất đặc biệt như có tính chịu nén cao, khuếch tán nhanh, độ nhớt và sức căng bề mặt thấp… Do đó, nó có khả năng khuếch tán mạnh vào nền nguyên liệu tốt hơn nhiều so với các dung môi thông thường, vì thế làm tăng hiệu suất chiết lên nhiều lần. Trong phương pháp này, thường dùng CO2 trạng thái siêu tới hạn làm dung môi chiết (đôi khi trộn với vài % dung môi phân cực nào đó như etanol, 2-propanol để làm tăng khả năng hòa tan carotenoid của CO2) do nó cho phép chiết nhanh, chọn lọc, không làm oxy hóa carotenoit và an toàn trong vận hành.
c. Chiết dung môi tăng tốc (ASE: Accelerated Solvent Extraction) hay chiết dưới áp suất cao (PFE: Pressurized Fluid Extraction)
Đây cũng là một phương pháp chiết mới, cho phép chiết rất nhanh, tự động hóa, hiệu quả và tiết kiệm dung môi. Nguyên tắc của nó tương tựnhư phương pháp chiết Soxhlet cổ điển, ngoại trừ việc quá trình chiết được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao (nhưng vẫn dưới điểm tới hạn của dung môi sử dụng). Trong phương pháp ASE, nguyên liệu cần chiết được xay nhỏ, làm khô (thường là đông khô), rồi nhồi vào một ống chiết (extraction cell). Ống chiết này được đặt trong lò duy trì ở nhiệt độ thích hợp (có thểđiều chỉnh từ 40 – 200oC). Dung môi được bơm vào ống chiết
và giữở áp suất 10 -20 MPa trong vài phút (static time), sau đó dịch chiết được đẩy vào một bình hứng bằng một thể tích dung môi mới (flush volume). Quá trình được lặp lại vài lần (cycles). Cuối cùng, toàn bộ dịch chiết được đẩy ra bằng một dòng khí trơ (N2).
1.5. LÝ THUYẾT CHUNG VỀ PHƯƠNG PHÁP SO MÀU
Một trong những kĩ thuật phân tích hữu hiệu nhất trong sinh học là phương pháp so màu. Trong phương pháp này, nồng độ của các hợp chất màu được xác định bằng cách đo cường độ màu của dung dịch chứa hợp chất đó. Các phương pháp đo quang phổthường được đo trong dãy bước sóng 200 nm - 800 nm. Dãy quang phổ này được chia thành 3 vùng: vùng tử ngoại (200 nm - 400 nm), vùng khả kiến (396 - 760 nm), vùng hồng ngoại (800 - 2000 nm). Trong đó vùng hồng ngoại rất ít được sử dụng trong hóa sinh, vùng khả kiến được sử dụng trong phương pháp phân tích so màu [1].
Khi dòng ánh sáng trắng xuyên qua dung dịch màu thì chỉ có các bước sóng nhất định sẽ bị hấp thụ và những bước sóng khác hầu như không bị hấp thụ và màu của dung dịch mà ta nhìn thấy chính là màu của các bước sóng không bị hấp thụ (Bảng 1.3).
Cường độ màu của dung dịch có thể được xác định bằng cách đo cường độ ánh sáng hấp thụ bởi hợp chất màu có trong dung dịch. Vì dùng ánh sáng trắng để đo cường độ màu, nên ánh sáng hấp thụ cách càng xa càng tốt những bước sóng không hấp thụ bởi dung dịch màu, vì vậy tốt nhất là nên dùng ánh sáng đơn sắc [3].
Bảng 1.6. Tính chất màu của dung dịch trong vùng ánh sáng trắng
Ánh sáng trắng tới Ánh sáng hấp thụ không hÁnh sáng ấp thụ dung dMàu củịch a
Ánh sáng trắng
Vàng và xanh da
trời Đỏ Đỏ
Xanh da trời Đỏ và vàng Da cam Xanh da trời và đỏ Vàng Vàng
Đỏ Vàng và xanh da trời Xanh lá cây Đỏ và vàng Xanh da trời Xanh da trời Vàng Xanh da trời và đỏ Tím
Phương pháp phân tích đo màu dựa vào định luật Lambert- Beer
Nguyên tắc
Khi ta chiếu một chum sáng đơn sắc có cường độ Io vào một cuvet chứa dung dịch mẫu có độ dài l thì một phần chùm sáng đi qua cuvet, một phần phản xạ và tán xạra các phương do va đập vào thành cuvet và một phần bị các phân tử trong cuvet hấp thụ. Trong đó, phần hấp thụ bởi các phân tử chất màu trong cuvet là chính [4].
Nếu sau khi đi qua cuvet cường độ ánh sáng còn là I thì ta có sự hấp thụ ánh sáng đơn sắc của các phân tửtrong cuvet được biểu diễn bởi công thức:
D = log = .L.C Trong đó:
: Hệ số hấp thụ phân tử (L.mol-1.cm-1) L: chiều dài cuvet (cm)
C: nồng độ của chất hấp thụ (mol/L)
Màu của dung dịch là do sự hấp thụkhông đồng đều các vùng khả kiến, khi có tia sáng đi qua dung dịch màu, không phải tất cả các tia phổđều bị hấp thụ với mức độ giống nhau, có phần tia hầu như không bị hấp thụ. Mỗi dung dịch màu của các hợp chất khác nhau có đường cong hấp thụ khác nhau hay có phổ hấp thụ khác nhau. Để có đường cong hấp thụ người ta tiến hành đo mật độ quang học của dung dịch màu đó ởcác bước sóng khác nhau và độ dài của bước sóng từ 400 nm (tím) – 700 nm (đỏ) [5].
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu mẫu nghiên cứu là cây lá Cẩm xay, Cây lá Cẩm thu mua tại mua tại chợ Thiết Quận 11 thành phố Hồ Chí Minh.
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
a. Hóa chất
- Cồn 96% (C2H5OH ) (Việt Nam), cloroform (Merck), n-hexan (Trung Quốc), etylaxetat (Trung Quốc), etanol (Merck).
b. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Thiết bị đo sắc ký khí ghép phổ khối (GC- MS) của Trung tâm Chất lượng Nông lâm Thủy sản Vùng 2.
- Thiết bị đo (HPLC), (AAS) của Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh Thực phẩm khu vực miền Trung - Viện Pasteur Nha Trang.
- Máy đếm khuẩn lạc, tủ an toàn sinh học, tủấm tại Trung tâm Y tế Dự phòng Quảng Nam.
- Máy UV – VIS của khoa Hóa, Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
- Máy sấy phun mini – B290 – Standard mini spray dryver của Trường Cao đẳng Lương thực - Thực phẩm, quận Sơn Trà- TP. Đà Nẵng.
- Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, máy đo pH, bộ soxhlet, bộ chưng ninh. Các dụng cụ thí nghiệm khác như: cốc thủy tinh, bình tam giác, chén sứ, ống nghiệm, bếp cách thủy, pipet, bình định mức, nhiệt kế, bình hút ẩm, giấy lọc…
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1. Phương pháp trọng lượng 2.2.1. Phương pháp trọng lượng
Độ ẩm và hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp trọng lượng.
2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)
a. Sự xuất hiện của phổ hấp thụ nguyên tử
Nếu ta chiếu một chùm tia sáng có bước sóng xác định vào đám hơi nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạcó bước sóng ứng đúng với những tia bức xạ mà có thể phát ra được trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử.
Nghiên cứu sự phụ thuộc cường độ một vạch phổ hấp thụ của một nguyên tố vào nồng độ C của nguyên tố đó trong mẫu phân tích, người ta rút ra được kết luận sau: Trong một vùng nồng độ nhỏ, mối quan hệ giữa cường đồ vạch hấp thụ và số nguyên tử của các nguyên tốđó trong đám hơi cũng tuân theo định luật Lambert – Beer .
D = C.L
b. Nguyên tắc của phép đo phổ hấp thụ nguyên tử
Trong điều kiện bình thường, nguyên tử không hấp thụhay phát ra năng lượng dưới dạng các bức xạ. Lúc này nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản, đó là trạng thái năng lượng bền vững và nghèo năng lượng nhất của nguyên tử. Nhưng khi ở trạng thái hơi nguyên tử tự do, nếu ta chiếu một chùm tia sáng có những bước sóng (tần số) xác định vào đám hơi nguyên tử đó thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạcó bước sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thểphát ra được trong quá trình phát xạ. Lúc đó nguyên tửđã nhận năng lượng dưới dạng các tia bức xạ và nó chuyển lên trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn trạng thái cơ bản. Quá trình đó được gọi là quá trình hấp thụ năng lượng nguyên tử. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử [7].
Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử, đám hơi nguyên tử mẫu trong ngọn lửa hay trong cuvet graphit là môi trường hấp thụ bức xạ. Phần tử hấp thụ năng lượng muốn có phổ hấp thụ nguyên tửthì trước hết phải tạo ra được đám hơi nguyên tử tự do và sau đó, chiếu vào nó một chum tia sáng có những bước sóng xác định ứng đúng với các tia phát xạ của nguyên tố cần nghiên cứu. Khi đó các nguyên tử tự do sẽ hấp thụnăng lượng và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử của nó.
2.2.3. Phương pháp so màu
tối ưu của quá trình chiết.
2.2.4. Phương pháp phân tích và định danh thành phần hóa học của các dịch chiết