3.1.1. Độ ẩm mẫu nguyên liệu
Bằng phương pháp trọng lượng, độ ẩm của mẫu nguyên liệu cây lá Cẩm được xác định và tổng hợp ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của mẫu nguyên liệu cây lá Cẩm
STT G (g) G1 (g) G2 (g) %H2O
1 3,1504 32,8506 32,5243 10,3574
2 3,3732 34,7674 34,4193 10,3196
3 3,6086 31,4023 31,0325 10,2477
Độẩm trung bình (%) 10,3082
Kết quả trên Bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình trong bột mẫu nguyên liệu cây lá Cẩm là 10,3082 %. Với độ ẩm này nằm trong khoảng tiêu chuẩn bảo quản của mẫu nguyên liệu dược liệu 10 – 14%. Do vậy nguyên liệu sẽ bảo quản được trong thời gian dài và nguyên liệu sử dụng trong chiết tách có tính ổn định.
3.1.2. Xác định hàm lượng tro
Bằng phương pháp định lượng, hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định và trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm lượng tro mẫu nguyên liệu cây lá Cẩm
STT mo (g) m1 (g) m2 (g) %Htro
1 5.018 35,502 35,990 9,725
2 5.027 36,280 36,763 9,608
3 5.021 34,760 35,252 9,799
Hàm lượng tro trung bình (%) 9,711
lá Cẩm là 9,711 % là hàm lượng trung bình đối với mẫu thực vật (15- 20 %). Với hàm lượng này dựbáo hàm lượng kim loại nặng có của cây lá Cẩm là không lớn.
3.1.3. Xác định hàm lượng kim loại nặng
Hàm lượng một số kim loại nặng của cây lá Cẩm được xác định bằng phương pháp AAS. Kết quảđược thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại trong cây lá Cẩm
STT Kim loại Phương pháp thử (AAS) Kết quả (μg/l) Kết quả (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) 1 Pb TCVN 8126:2009 0,502 0,05 ≤ 2,00 2 As AOAC 986.15 KPH KPH (LOD = 0,021) ≤ 1,00 3 Cr TCVN 8126:2009 0,422 0,04 ≤ 2,00 4 Hg TCVN 7993:2009 KPH KPH (LOD = 0,013) ≤ 0,05
Bảng 3.3. thấy thành phần kim loại nặng Pb, As, Cr, Hg có của cây lá Cẩm là tương đối thấp. Đây là một trong những chỉ số quan trọng để đánh giá việc sử dụng cây lá Cẩm làm dược liệu an toàn. Vì vậy ta có thể nhận thấy là khi sử dụng cây lá Cẩm thì hàm lượng kim loại nặng không ảnh hưởng đến sức khoẻcon người.
3.1.4. Xác định tỉ trọngcủadịch chiết etanol
Chuẩn bị 5 bình cầu và lần lượt cho vào từng bình theo tỷ lệ 1g nguyên liệu/ 50ml cồn. Đun hồi lưu trên bếp cách thủy với thời gian thay đổi, nhiệt độ 80 oC. Sau khi đun xong cho 5 bình lần lượt vào từng cốc rồi ta cô cạn từng cốc để đưa thể tích10ml. Đo tỉ trọng, sử dụng bình tỉ trọng 10 ml, rửa sấy khô bình tỷ trọng , cho 10ml cồn vào bình tỷ trọng đem cân được giá trị m1
Tiếp tục rửa và sấy khô rồi cho dịch chiết vào đem cân thu được khối lượng m2. Tỉ trọng được tính theo công thức sau: d = (m2 – m1): 10 (g/mL)
Kết quả trình bày ở Bảng 3.4
Bảng 3.4. Tỉ trọng của dịch chiết theo thời gian
Thời gian m1 (gam) m2 (gam) Tỉ trọng(g/mL)
70 phút 24,60 24,67 0,007
90 phút 24,60 24,67 0,007
110 phút 24,60 24,68 0,008
130 phút 24,60 24,68 0,008
Qua bảng 3.4 cho thấy với thời gian 110 phút thì tỉ trọng không thay đổi, các chất được chiết ra xem như hoàn toàn. Sau thời gian chiết 110 phút tỉ trọng 0,008. Tương đương có có 0,008 gam cao chiết trong 1 mL dịch chiết.
3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ
3.2.1. Kết quả nghiên cứu thu dịch chiết bằng dung môi n-hexan
a. Dịch chiết n-hexan của cây lá Cẩm
Điều kiện tiến hành: Bột cây lá Cẩm 10 g, thể tích dung môi là 200 ml n-hexan; thời gian chiết: 2, 4, 6, 8 giờ. Tiến hành chiết soxhlet trên bếp cách thủy ở nhiệt độ từ khoảng 68oC - 78oC. Sau đó, tiến hành cô dung môi để thu cao chiết. Khối lượng cao chiết được trình bày trên Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu được
Thời gian chiết (giờ) 2 4 6 8
Khối lượng cao chiết (g) 0,20 0,24 0,29 0,29
Bảng 3.5 ta thấy, thời gian chiết từ 2 giờđến 8 giờ thì khối lượng cao chiết thu được có tăng theo thời gian nhưng từ 6 giờ đến 8 giờ thì khối lượng cao có tăng nhưng không đáng kể. Điều này có thể giải thích là do khi tăng thời gian chiết các chất của cây lá Cẩm không hòa tan thêm được. Vậy thời gian chiết tốt nhất là 6 giờ.
b. Định danh thành phần hóa học trong dịch n-hexan của cây lá Cẩm bằng GC-MS
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-hexan từ cây lá Cẩm được thể hiện ở Hình 3.1 và kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan được trình bày ở Bảng 3.6.
Hình 3.1. Sắc ký đồ GC – MS của dịch chiết n-hexan của cây lá Cẩm
Bảng 3.6. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan của cây lá Cẩm STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 1 6.047 6.094 Benzen, 1,2,3,5-tetramethyl- 2 6.45 5.303 Naphthalene 3 7.569 0.972 Naphthalene, 2-methyl- 4 13.28 6.231 2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl- 5 14.442 1.083 n-Hexadecanoic acid
STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 6 15.891 15.002 Phytol 7 16.181 0.842 Z-(13,14-Epoxy)tetradec-11-en-1-ol acetate 8 16.801 0.863 E-8-Methyl-9-tetradecen-1-ol aceate 9 18.008 1.412 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4-olide 10 18.405 1.043 Tetracosane 11 19.209 1.681 Heneicosane 12 19.48 36.87 Di-n-octyl phthalate 13 19.984 1.773 Pentacosane 14 20.73 1.659 Octacosane 15 21.447 0.947 Squalene 16 21.564 7.338 Heptacosane
17 22.184 0.763 1-Monolinoleoylglycerol trimethylsilyl ether 18 25.633 2.740 Campesterol
19 25.953 3.610 Stigmasterol 20 26.815 3.776 y-Sitosterol
Từ kết quảở Bảng 3.6 cho ta thấy phương pháp GC – MS đã định danh được 20 cấu tử trong dịch chiết n-hexan từ cây lá Cẩm. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan chủ yếu là những cấu tửcó độ phân cực yếu đến không phân cực, bao gồm các hidrocacbon và các acid hữu cơ tồn tại chủ yếu ở dạng tự do và este do có cấu trúc tương tự nên các cấu tử này dễ dàng phân bố vào dung môi n-hexan
Các cấu tử có hàm lượng cao như: Di-n-octyl phthalate chiếm 36,9%, thích hợp để làm mỹ phẩm, đồ chơi trẻ em vì không độc hại [15]. Phytol chiếm 15 %, chất này là tiền chất sản xuất ra các loại vitamin E và K1, nó thích hợp để làm mỹ phẩm, nước hoa, dầu gội đầu…[16]
3.2.2. Kết quả nghiên cứu thu dịch chiết cây lá Cẩm bằng dung môi clorofom
a. Dịch chiết clorofom của cây là Cẩm
Điều kiện tiến hành: 10 gam bột cây lá Cẩm, thể tích dung môi là 200ml clorofom; ta tiến hành khảo sát thời gian chiết lần lượt là 2, 4, 6, 8 giờ. Tiến hành chiết soxhlet trên bếp cách thủy ở nhiệt độ khoảng 62-72oC. Sau đó, tiến hành cô dung môi để thu cao chiết rồi đem cao chiết thu được đi cân. Kết quảđược trình bày ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu được
Thời gian chiết (giờ) 2 4 6 8
Khối lượng cao chiết (g) 0,35 0,40 0,42 0,42 Qua Bảng 3.7 ta thấy, thời gian chiết từ 2 giờ đến 8 giờ và khối lượng cao chiết thu được có tăng theo thời gian nhưng từ 6 giờ đến 8 giờ thì khối lượng cao chiết không tăng. Điều này có thể giải thích là do khi tăng thời gian chiết các chất của cây lá Cẩm không hòa tan thêm được. Vậy thời gian chiết tốt nhất dung môi clorofom là 6 giờ.
b. Định danh thành phần hóa học có trong dịch chiết clorofom của cây lá
Cẩm bằng GC-MS
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết clorofom từ cây lá Cẩm được thể hiện ở Hình 3.2 và kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết clorofom được thể hiện ở Bảng 3.8.
Hình 3.2. Sắc ký đồ GC – MS của dịch chiết clorofom từ cây lá Cẩm
Bảng 3.8. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết clorofom của cây lá Cẩm STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 1 9.38 1.071 2,5-dimethoxythiophenol
2 12.645 0.538 Acetic acid, 2-(2,2,6-trimethy-7-oxa-bicyclo[4.1.0]- hept-1-yl)-propenyl ester
3 12.761 0.577 2-cyclohexen-1-one, 4-hydroxy-3,5,5-trimethyl-4- (3-oxo-1-butenyl)-
4 13.28 3.066 2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl- 5 14.776 0.685 Hexadecanoic acid, ethyl ester 6 15.891 2.699 Phytol
7 17.572 2.049 7-Methyl-Z-tetradecen-1-ol acetate 8 18.012 0.631 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4-olide
STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 9 18.41 4.450 Teracosane 10 19.214 7.163 Heneicosane 11 19.49 48.90 Di-n-octyl phthalate 12 19.984 8.205 Pentacosane 13 20.73 6.978 Octacosane 14 21.452 4.44 Heptacosane 15 21.563 2.728 Squalene
16 22.188 2.552 1-Monolinoleoylglyxerol trimethylsilyl ether 17 25.633 0.763 Campesterol
18 25.957 1.178 Stigmasterol 19 26.815 1.33 γ-Sitosterol
Bảng 3.8 cho ta thấy phương pháp GC – MS đã định danh được 19 cấu tử trong dịch chiết clorofom từ cây lá Cẩm. Thành phần hóa học trong dịch chiết clorofom chủ yếu là những cấu tử có độ phân cực yếu đến không phân cực, bao gồm các hidrocacbon dài 21C 27C
Các cấu tửcó hàm lượng cao như: Di-n-octyl phthalate (48.9 %), Pentacosane (8,20 %), Heneicosane ( 7.163 %).
3.2.3. Kết quả nghiên cứu thu dịch chiết bằng dung môi etylaxetat
a. Dịch chiết etylaxetat trong của cây lá Cẩm
Điều kiện chiết tách: 10 gam bột cây lá Cẩm, thể tích dung môi etylaxetat là 200ml; thời gian chiết: 2, 4, 6, 8 giờ. Tiến hành chiết soxhlet trên bếp cách thủy ở nhiệt độ từ khoảng 78 - 88oC. Sau đó, tiến hành cô dung môi để thu cao chiết rồi đem cao chiết thu được đi cân. Khối lượng cao chiết được trình bày ở Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu được
Thời gian chiết (giờ) 2 4 6 8
Khối lượng cao chiết (g) 0,17 0,20 0,22 0,22
Bảng 3.9 ta thấy, thời gian chiết từ 2 giờ đến 6 giờ và khối lượng chất thu được tăng theo thời gian, sau 6 giờ thì khối lượng cao chiết đạt lớn nhất. Điều này có thể giải thích là do khi tăng thời gian chiết các chất của cây lá Cẩm không hòa tan thêm được nữa. Vậy tôi chọn thời gian chiết tốt nhất của dung môi etylaxetat là 6 giờ.
b. Định danh thành phần hóa học trong dịch chiết etylaxetat của cây lá Cẩm bằng GC - MS
Dịch chiết etylaxetat của cây lá Cẩm được xác định thành phần hóa học bằng phương pháp GC-MS. Trên sắc kí đồ nhận được sẽ có các tín hiệu peak ứng với các cấu tử được tách. So sánh thời gian lưu với thư viện phổ có thểxác định được tên chất và đo diện tích mỗi peak ta xác định được hàm lượng mỗi chất trong hỗn hợp được nhận diện.
Sắc kí đồ GC-MS của dịch chiết etylaxetat của cây lá Cẩm được thể hiện ở Hình 3.3 và kết quảđịnh danh thành phần hóa học được thể hiện ở Bảng 3.10.
Hình 3.3. Sắc ký đồ GC – MS của dịch chiết etylaxetat của cây lá Cẩm
Bảng 3.10. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết etylaxetat của cây lá Cẩm STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 1 5.413 1.132 1,2,3-Propanetriol, 1-acetate 2 5.737 0.985 2,5-Dihydroxy-1,4-dioxane, bis(tert- butyldimethylsilyl) ether
3 6.726 0.665 Hexadecanoic acid, 3-hydroxy-, methyl ester 4 8.469 0.66 Tetradecane
5 9.375 2.614 2,5-Dimethoxythiophenol
6 12.645 0.606 Acetic acid, 2-(2,2,6-trimethyl-7-oxa- bicyclo[4.1.0]hept-1-yl)-propenyl ester
STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 7 12.761 0.734 2-Cyclohexen-1-one, 4-hydroxy-3,5,5-trimethyl-4- (3-oxo-1-butenyl)- 8 13.28 5.912 2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl- 9 14.442 1.211 n-Hexadecanoic acid 10 15.891 12.82 Phytol 11 16.806 1.753 Phytol,acetate 12 18.008 1.442 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4-olide 13 18.405 1.098 Tetracosane 14 19.209 1.964 Heneicosane 15 19.48 49.23 Di-n-octyl phthalate 16 19.984 2.073 Pentacosane 17 20.73 1.979 Octacosane 18 21.447 1.132 Squalene 19 21.563 4.214 Heptacosane
20 22.184 0.793 1-Monolinoleoylglycerol trimethylsilyl ether 21 25.633 1.753 Campesterol
22 25.957 2.609 Stigmasterol 23 26.81 2.624 γ-Sitosterol
Từ kết quả ở Bảng 3.10 cho ta thấy phương pháp GC – MS đã định danh được 23 cấu tử trong dịch chiết etylaxetat từ cây lá Cẩm. Thành phần hóa học trong dịch chiết n- n-hexane chủ yếu là những cấu tửcó độ phân cực yếu đến không phân cực. Các cấu tử có hàm lượng cao như: Di-n-octyl phthalate (49.23%), 2- Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl-(5,91%), Heptacosane (4,2%) γ-Sitosterol ( 2.624%)
c. Định danh chất màu của dịch chiết etylaxetat từ cây lá Cẩm bằng HPLC và LC-MS
Dịch chiết chiết etylaxetat từ cây lá Cẩm được đo HPLC đầu dò DAD ởbước sóng 522 nm. Kết quảở Hình 3.4 cho thấy có một peak ứng với thời gian lưu
18,024 chiếm 98,173%.
Hình 3.4. Sắc kí đồ chiết etylaxetat của cây lá Cẩm
Tiến hành khảo sát trên hệ thống LC-MS với chếđộ scan giá trị m/z từ 200 đến 1200. Tín hiệu ở phút 18 trên hệ HPLC cho tín hiệu ở phút 19,169 trên hệ LC- MS, phổ khối lượng được trình bày ở Hình 3.5
Hình 3.5. Phổ khối lượng của dịch chiết etylaxetat từ cây lá Cẩm, tại phút thứ 19 trên hệ LC-MS
Hình 3.5 cho thấy có giá trị m/z = 595,4 ứng với hợp chất cyanidin - 3- rutinoside và 534,4 ứng với hợp chất cyanidin 3- malonyglucoside[14 ].
3.2.4. Kết quả nghiên cứu thu dịch chiết bằng dung môi etanol
a. Dịch chiết etanol của cây lá Cẩm
Điều kiện tiến hành: 3 gam bột cây lá Cẩm, thể tích dung môi là 150 ml etanol; thời gian chiết: 70, 90, 110, 130 phút. Tiến hành chiết soxhlet trên bếp cách thủy ở nhiệt độ từ khoảng 80oC- 90oC. Sau đó, tiến hành cô dung môi để thu cao chiết rồi đem cao chiết thu được đi cân. Kết quả khối lượng cao thu thu được là 0,20 gam. Khối lượng cao chiết được trình bày ở Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu được
Thời gian chiết (phút) 70 90 110 130
Khối lượng cao chiết (g) 0,15 0,17 0,20 0,20
Bảng 3.11 ta thấy, thời gian chiết từ 70 phút đến 130 phút khối lượng chất thu được tăng theo thời gian, sau 110 phút thì khối lượng cao chiết đạt lớn nhất. Điều này có thể giải thích là do khi tăng thời gian chiết các chất của cây lá Cẩm không hòa tan thêm được nữa. Vậy tôi chọn thời gian chiết tốt nhất của dung môi etanol là 110 phút.
b. Định danh thành phần hóa học trong dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm bằng GC - MS
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm được thể hiện ở Hình 3.6 và kết quảđịnh danh thành phần hóa học trong dịch chiết etanol được tổng hợp ở Bảng 3.12.
Hình 3.6. Sắc kí đồ GC – MS của dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm
Bảng 3.12. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết etanol của cây lá Cẩm STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 1 8.449 0.55 Dithiocarbamate,S-methyl-,N-(2-methyl-3- oxobutyl)- 2 9.365 7.257 2,5-Dimethoxythiophenol 3 9.646 1.522 Phen, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)- 4 10.038 0.78 3,5-Dimethoxy-4-hydroxybenzyl alcohol 5 10.101 0.802 2(4H)-Benzofuranone,5,6,7,7A-tetrahydro- 4,4,7a-trimethyl-, (R)- 6 10.305 1.355 2-Tertbutyl cyclohexyl
STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi propylphosphonofluoridate 7 10.595 0.84 2-Hexadecanol 8 10.673 0.907 Geranyl isovalerate 9 11.215 1.245 2-Cyclohexen-1-one, 4-(3-hydroxy-1- butenyl)-3,5,5-trimethyl- 10 11.675 1.637 1-{2-[3-(2-Acetyloxiran-2-yl)-1,1- dimethylpropyl]cycloprop-2-enyl}ethanone
11 12.63 1.715 Ppropiolic acid, 3-(1-hydroxy-2-isopropyl-5- methlcyclohexyl)-
12 12.751 5.262 2-Cyclohexen-1-one, 4-hydroxy-3,5,5- trimethyl-4-(3-oxo-1-butenyl)-
13 12.828 0.867 Tetradecane,2,6,10-trimethyl-
14 13.26 3.78 2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl- 15 14.756 2.877 Hexadecanoic acid, ethyl ester 16 15.875 25.00 Phytol 17 16.684 0.975 1-Heptatriacotanol 18 16.786 1.417 E,E,Z-1,3,12-Nonadecatriene-5,14-diol 19 17.552 1.315 17-Pentatriacontene 20 17.988 1.235 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4-olide 21 18.259 2.372 Ethanol, 2-(9_octadecenyloxy)-, (Z)- 22 18.385 1.13 Tetrapentacontane, 1,54-dibromo- 23 19.184 0.965 Heneicosane 24 19.446 16.1 Di-n-octyl phthalate 25 19.756 1.052 E-8-Methyl-9-tetradecen-1-ol acetate