2.2.1. Phương pháp trọng lượng
Độ ẩm và hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp trọng lượng.
2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)
a. Sự xuất hiện của phổ hấp thụ nguyên tử
Nếu ta chiếu một chùm tia sáng có bước sóng xác định vào đám hơi nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạcó bước sóng ứng đúng với những tia bức xạ mà có thể phát ra được trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử.
Nghiên cứu sự phụ thuộc cường độ một vạch phổ hấp thụ của một nguyên tố vào nồng độ C của nguyên tố đó trong mẫu phân tích, người ta rút ra được kết luận sau: Trong một vùng nồng độ nhỏ, mối quan hệ giữa cường đồ vạch hấp thụ và số nguyên tử của các nguyên tốđó trong đám hơi cũng tuân theo định luật Lambert – Beer .
D = C.L
b. Nguyên tắc của phép đo phổ hấp thụ nguyên tử
Trong điều kiện bình thường, nguyên tử không hấp thụhay phát ra năng lượng dưới dạng các bức xạ. Lúc này nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản, đó là trạng thái năng lượng bền vững và nghèo năng lượng nhất của nguyên tử. Nhưng khi ở trạng thái hơi nguyên tử tự do, nếu ta chiếu một chùm tia sáng có những bước sóng (tần số) xác định vào đám hơi nguyên tử đó thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạcó bước sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thểphát ra được trong quá trình phát xạ. Lúc đó nguyên tửđã nhận năng lượng dưới dạng các tia bức xạ và nó chuyển lên trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn trạng thái cơ bản. Quá trình đó được gọi là quá trình hấp thụ năng lượng nguyên tử. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử [7].
Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử, đám hơi nguyên tử mẫu trong ngọn lửa hay trong cuvet graphit là môi trường hấp thụ bức xạ. Phần tử hấp thụ năng lượng muốn có phổ hấp thụ nguyên tửthì trước hết phải tạo ra được đám hơi nguyên tử tự do và sau đó, chiếu vào nó một chum tia sáng có những bước sóng xác định ứng đúng với các tia phát xạ của nguyên tố cần nghiên cứu. Khi đó các nguyên tử tự do sẽ hấp thụnăng lượng và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử của nó.
2.2.3. Phương pháp so màu
tối ưu của quá trình chiết.
2.2.4. Phương pháp phân tích và định danh thành phần hóa học của các dịch chiết dịch chiết
Trong luận văn này, tôi phân tích và định danh thành phần hóa học các dịch chiết n- n-hexane, clorofom, etyl axetat, etanol từ cây lá Cẩm bằng phương pháp đo sắc kí khí ghép phổ khối (GC-MS), sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc kí lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC-MS).
► Phương pháp GC - MS dựa trên cơ sở “nối ghép” máy sắc kí khí (Gas Chromatography) với máy khối phổ (Mass Spectometry).
Hệ thống sắc kí khối phổ là một detector khối phổ được ghép nối với thiết bị sắc kí khí nối với nhau qua bộ kết nối nhằm mục đích loại bớt khí mang như N2, He để giảm áp suất của dòng khí mang và phân tử mẫu chất đi vào buồng ion hóa của khối phổ. Phần thiết bị sắc kí dùng làm mao quản, phần phổ khối sử dụng buồng ion hóa và bộ tách từ cực và detector khối phổ.
Sau khi đi qua các cột sắc kí khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. Ở đây chúng bị ion hóa. Sau khi đi qua khối phổ chúng sẽ tới bộ phận lọc, dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua.
Thiết bị cảm biến có nhiệm vụđếm sốlượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau đó chuyển đến máy tính và xuất kết quả gọi là khối phổ. Khối phổ là một biểu đồ phản ánh sốlượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc.
+ Xác định công thức phân tử, dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị xuất hiện trên phổđồ.
+ Xác định công thức cấu tạo: dựa vào giá trị m/e, cường độ tương đối giữa các ion phân tửcũng như ion màng.
+ Định lượng thành phần nguyên tố của ion cần xác định.
► Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn
hợp mẫu, qua một cột sắc ký. Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn. Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tớisự phân tách các thành phần khí mà chúng chảy ra khỏi cột. HPLC được phân biệt với sắc ký lỏng truyền thống áp suất thấp bởi vì áp suất hoạt động của nó cao hơn nhiều (50-350 bar), trong khi sắc ký lỏng thông thường chỉ dự trên lực hút trái đất để pha động đi qua cột. Do chỉ có một lượng nhỏ mẫu được tách bằng phân tích HPLC, cột có kích thước 2.1-4.6 mm cho đường kính và 30–250 mm cho chiều dài. Cột HPLC cũng đổ với kích thước hạt hấp phụ nhỏ hơn (trung bình kích thước hạt 2-50 micro mét). Điều này mang lại HPLC hiệu quả phân giải cao (khả năng táchbiệt từng chất) khi mà tách hỗn hợp, làm cho nó trở thành phương pháp sắc ký phổ biến. Sơ đồ của một thiết bị HPLC đặc thù gồm có cổng lấy mẫu, bơm, và một đầu dò. Cổng lấy mẫu đưa hỗn hợp mẫu và dòng pha động để đi qua cột. Hệ thống bơm đảm bảo tốc độ dòng mong muốn và thành phần của qua động qua cột. Đầu dò tạo ra tín hiệu tỷ lệ với lượng mẫu thành phần đi ra từ cột, do đó cho phép phân tích định lượng của những thành phần trong mẫu. Một bộ vi xử lý số và phần mềm điều khiển thiết bị HPLC và cung cấp dữ liệu phân tích. Một vài mẫu bơm cơ trong thiết bị HPLC có thể trộn nhiều dung môi với nhau trong những tỉ mà thay đổi theo thời gian, tạo ra thành phần gradient trong pha động. Các đầu dò như UV/Vis, PDA hay khối phổ được sử dụng phổ biến. Phần lớn các thiét bị HPLC có lò cột để điều chỉnh nhiệt độ phân tách. Hỗn hợp mẫu để phân tích và tách có thể tích rất nhỏ được đưa vào dòng pha động đang thấm qua cột. Những thành phần của mẫu đi qua cột với tốc độ khác nhau, đây là chức năng của những tương tác vật lý cụ thể với chất hấp phụ của cột (còn gọi là pha tĩnh). Tốc độ của từng thành phần phụ thuộc vào bản chất hoá học tự nhiên nó trên pha tĩnh và thành phần của pha động. Thời gian mà một chất phân tích rửa giải ra khỏi cột gọi là thời gian lưu. Thời gian lưu được đo trong những điều kiện đặc trưng và được xem là đặc điểm nhận biếtcủa chất đem phân tích.
Có nhiều loại cột khác nhau, được làm bằng những chất hấp phụ có kích thước hạt và bề mặt tự nhiên thay đổi. Việc sử dụng những vật liệu có hạt có kích thước nhỏ
hơn đổ cột yêu cầu áp suất hoạt động cao hơn và điển Hình cải thiện độ phân giải sắc ký (mức độ phân tách giữa những chất phân tích đi ra từ cột nối tiếp nhau). Xét về bề mặt hóa học, những hạt hấp phụ có thể có cực hay không cực. Các pha động thường được sử dụng bao gồm sự kết hợp có thể trộn lẫn của nước với dung mỗi hữu cơ khác nhau (phổ biến nhất là acetonitrile và methanol). Một số kỹ thuật HPLC sử dụng dung môi không nước. Thành phần nước trong pha động có thể có axít (axít formic, photphoric hay trifluoroacetic) hoặc muối để hỗ trợ sự phân tách các thành phần mẫu. Thành phần pha động có thể được giữ cố định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi (rửa giải gradient) trong quá trình phân tích sắc ký. Rửa giải đẳng dòng đặc biệt hiệu quả trong phân tách những thành phần mẫu không khác nhau nhiều về ái lực của chúng với pha động. Với rửa giải gradient thành phần của pha động được thay đổi từ thấp tới cao để tăng sức rủa giải. Sức rửa giải của pha động được phản ánh bằng thời gian lưu của mẫu, sức rửa giải cao thì thời gian lưu của mẫu ngắn.
►LC-MS
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó. Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn. Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai kiểu quét này thành một nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu, tuy nhiên thường độ nhạy không caobằng từng kiểu quét riêng lẻ. Trong rất nhiều năm,
các nhà nghiên cứu kỹ thuâ ̣t sắc ký lỏng ghép khối phổ phải đối mă ̣t với rất nhiều khó khăn trong viê ̣c tı̀m cách giải quyết được sựtương thı́ch giữa hê ̣ thống sắc ký lỏng vàđầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trı̀nh phân tı́ch với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiê ̣t đô ̣ cao, các chất khảo sát phải ở tra ̣ng thái khı́, vâ ̣n tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hê ̣ thống LC la ̣i hoa ̣t đô ̣ng ở áp suất cao với mô ̣t lượng dung môi tương đối lớn, nhiê ̣t độtương đối thấp, các chất phân tı́ch ở thể lỏng.
Để khắc phục những khókhăn trên, cần phải có mô ̣t kỹ thuâ ̣t trung gian gọi là giao diê ̣n. Rất nhiều kỹ thuâ ̣t giao diê ̣n (interface technology) như chùm tia ha ̣t (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB),… đãđược nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thâ ̣p nhiên 80, mới có sựđô ̣t phá thâ ̣t sự với kỹ thuâ ̣t ion hóa ta ̣i áp suất khı́ quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API). Ưu điểm nổi bật của API là khả năng Hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích. Có ba kiểu Hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:
• Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI).
• Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization – APCI).
• Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization – APPI).
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đă ̣c biê ̣t là ESI được sử dụng nhiều hơn cả.
Các loa ̣i đầu dò khối phổ
Hiê ̣n nay, có bốn kiểu đầu dò khối phổ chính đang được sử dụng bao gồm:
• Đầu dò khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, FTICR hay FT-MS).
• Đầu dò khối phổthời gian bay (Time-of-Flight, TOF)
• Đầu dò khối phổtứ cực (Quadrupole)
Chúng rất khác nhau về thiết kế và thao tác, với những ưu và nhược điểm riêng.
Đối với loại bẫy ion, các ion trước hết được bắt hoặc “mắc bẫy” trong một khoảng thời gian nhất định rồi được phân tích bằng MS hoặc MS/MS. Loại máy này được sử dụng khá rộng rãi (xét theo những công bố khoa học). Tuy nhiên, chúng có độ chính xác không cao do chỉ có một số lượng khá hạn chế các ion có thể tích lũy vào tâm điểm trước khi được tích điện trong không gian, do vậy có thể phản ánh sai lệch sự phân bố và phép đo. Người ta cũng đã tiến hành cải tiến kỹ thuật trên bằng sự phát triển các bẫy ion “tuyến tính” hoặc “hai chiều” khi những ion được tập hợp trong một thể tích Hình ống lớn hơn bẫy ion ba chiều truyền thống, cho phép làm tăng độ nhạy, độ phân giải và độ chính xác .
FT-MS bản chất cũng là một loại khối phổ bẫy ion, cho phép bắt những ion dưới độ chân không sâu trong một từ trường cao. Do được cải tiến và kết hợp cả hai loại máy nên FT-MS có độ nhạy, độ chính xác và phân giải cao. Tuy nhiên, do vận hành phức tạp và giá thành quá cao nên chúng ít được sử dụng trong phân tı́ch dư lượng.
Đối với đầu dò khối phổ thời gian bay, tất cả các ion đơn điê ̣n tı́ch nào chi ̣u mô ̣t sai biê ̣t về thế năng V sẽ đa ̣t mô ̣t năng lượng chuyển hóa eV (electron volt) như nhau. Vı̀ vâ ̣y, những ion có khối lượng lớn hơn sẽ có vâ ̣n tốc nhỏhơn nên mất nhiều thời gian hơn để bay qua cùng mô ̣t quãng đường dài trong mô ̣t ống không có từ trường (field-free flight tube). Các ion, sau khi được tăng tốc, bay ngang qua vùng không trường, nơi đây chúng sẽđược tách riêng nhau ra tùy theo giá tri ̣ m/z của chúng, và được tâ ̣p trung ta ̣i bô ̣ phâ ̣n thu nhâ ̣n tı́n hiê ̣u. Do thời gian đến đı́ch của các ion chı̉ cách nhau rất ngắn, 10-7 giây, nên máy cần có hê ̣ thống điê ̣n tử cực nha ̣y để có thể
phân biê ̣t được các ion. Đầu dò tứ cực (mô ̣t hoă ̣c ba tứ cực) có đô ̣ nha ̣y cao trong phân tı́ch đi ̣nh lượng mô ̣t chất đã biết, ta ̣o được nhiều phân mảnh trong chế đô ̣ MS/MS, có thể làm được kiểu đo mất phân tử trung hòa (neutral loss), thı́ch hợp cho phân tı́ch vi lượng các chất đã biết trước cấu trúc. Tuy nhiên, đầu dò tứ cực khó giải thı́ch cơ chế phân mảnh MS/MS. Tùy theo mục đích, các nhà nghiên cứu sẽ chọn cáckỹ thuật ứng với các máy khối phổ thích hợp. Ngoài ra, để phát huy những ưu điểm cũng như khắc phục các ha ̣n chế của từng loa ̣i đầu dò, người ta còn ghép nối kết hợp các kỹ thuâ ̣t với nhau, vı́ dụnhư hê ̣ thống kết hợp giữa bẫy ion và tứ cực API QTRAP4000 hay QTRAP5500 của hãng Appliedbiosystems, trong đó, tứ cực thứ ba của hê ̣ ba tứ cực được thay bằng bẫy ion.
Ion hóa hóa ho ̣c ở áp suất khı́ quyển (APCI) là kỹ thuâ ̣t ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi. Trong APCI, ion đươc Hình thành như sau: mẫu hợp chất