2.3.1. Sơ đồ thực nghiệm
a. Chiết bằng dung môi hữa cơ
Quá trình thực nghiệm được mô tảtheo sơ đồ thể hiện ở Hình 2.1.
Hình 2.1. Quy trình thực nghiệm Cây lá Cẩm Xử lý Bột lá Cẩm (Nguyên liệu) Đánh giá độ an toàn và ứng dụng phẩm màu lá Cẩm tạo một số sản phẩm thực phẩm Xác định độẩm Xác định hàm lượng tro clorofom Dịch chiết hexan Dịch chiết clorofom Dịch chiết etyl axetat Dịch chiết etanol Đo GC-MS, HPLC, LC-MS Chiết với cồn thực phẩm để thu phẩm màu cây lá Cẩm etyl axetat etanol n- hexan Chiết soxhlet Xác định hàm kim loại nặng
2.3.2. Xử lý nguyên liệu
Nguyên liệu là cây lá Cẩm thu mua tại chợ Thiết, Quận 11, thành phố Hồ Chí Minh (Hình 2.2).
Cây lá Cẩm tươi được thu mua về sơ chế, nhặt lá úa vàng đem rửa sạch và phơi khô.Sau đó xay nhỏ.
Hình 2.2. Cây lá Cẩm tươi và mẫu khô sau khi xử lý
2.3.3. Xác định các thông số hóa lí của nguyên liệu
a. Xác định độ ẩm
Nguyên tắc
Dùng nhiệt độcao đểlàm bay hơi nước hết trong mẫu phân tích.
Dựa vào hiệu khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy để tính hàm lượng nước có trong mẫu phân tích.
- Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứđể đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích. Tiến hành
- Chuẩn bị cốc sấy: Đem cốc đi rửa để ráo, sau đó sấy ở 105 ÷ 1100C trong vòng 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân.
- Chuẩn bị mẫu: Nguyên liệu lá cây lá Cẩm khô được xay nhỏ rồi cân chính xác 5g (G) cho vào 3 cốc sấy (đã được xác định chính xác khối lượng trước). Cân cốc có chứa mẫu (khối lượng G1). Đưa cốc có chứa mẫu sấy ở 60 ÷ 70oC trong vòng
30 phút, sau đó nâng nhiệt độ lên 105 ÷ 1100C và sấy trong vòng 1h. Lấy mẫu ra, để nguội trong bình hút ẩm và đem cân (khối lượng G2). Lặp lại quá trình sấy vài lần đến khi chênh lệch khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,001g. Ghi khối lượng cuối cùng (G2). Hàm lượng nước trong nguyên liệu tính theo công thức:
%H2O = A
G1-G2
G EA.100% Trong đó:
G1: khối lượng mẫu trước khi sấy (g) G2: khối lượng mẫu sau khi sấy (g) G: khối lượng mẫu (g)
b. Xác định hàm lượng tro
- Tro toàn phần: Là khối lượng rắn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một mẫu thửtrong điều kiện nhất định.
- Dụng cụ: cốc sứđựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích, bếp điện. - Cách tiến hành
Để xác định hàm lượng tro của cây lá Cẩm ta lấy vào 3 cốc sứ, mỗi cốc đựng khoảng 5 gam bột nguyên liệu (kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén sứ) rồi đem than hóa sơ bộ trên bếp điện. Sau đó, cho cốc sứ có chứa mẫu vào lò nung và nung ở nhiệt độ 400- 5000C (nếu nhiệt độ cao hơn thì một số các kim loại sẽ bị bay hơi). Sau thời gian tro hoá khoảng 7 giờ, ta thấy nguyên liệu bột cây lá Cẩm bị tro hoá hoàn toàn. Lúc này tro ở dạng bột, màu xám trắng. Cho cốc vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và ghi giá trị khối lượng. Tiếp tục cho cốc vào lò nung, nung 30 phút, lấy ra và thực hiện lại quá trình trên đến khi khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp nhau không đổi hoặc sai số ± 0.001g thì dừng lại. Hàm lượng tro của cây lá Cẩm được tính theo công thức:
%H = A
m2-m1
mo EA.100% Trong đó:
mo: khối lượng mẫu (g)
m2: khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hóa (g) %H: hàm lượng tro trong mẫu
c. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng
Lấy 1gam mẫu bột cây lá Cẩm phân hủy bằng lò vi sóng với dung dịch axit HNO3 đặc, sau quá trình phân hủy hòa tan và định mức đến 100 ml bằng nước deion. Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm lượng một số kim loại nặng là Pb, As, Cr, Hg bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh Thực phẩm khu vực miền Trung - Viện Pasteur Nha Trang.
Công thức tính hàm lượng kim loại nặng trong mẫu ban đầu như sau: C (mg/kg) = A
C(mg/l)
E
mo EA.V (ml) Trong đó:
mo: khối lượng mẫu cây lá Cẩm trước khi tro hóa (g). V: thểtích bình định mức (ml)
d. Đo tỉ trọng của dịch chiết etanol
Chuẩn bị 5 bình cầu và lần lượt cho vào từng bình theo tỷ lệ 1g nguyên liệu/ 50ml cồn. Đun hồi lưu trên bếp cách thủy với thời gian thay đổi, nhiệt độ 80 oC. Sau khi đun xong cho 5 bình lần lượt vào từng cốc rồi ta cô cạn từng cốc để đưa thể tích10ml. Đo tỉ trọng, sử dụng bình tỉ trọng 10 ml, rửa sấy khô bình tỷ trọng , cho 10ml cồn vào bình tỷ trọng đem cân được giá trị m1
Tiếp tục rửa và sấy khô rồi cho dịch chiết vào đem cân thu được khối lượng m2. Tỉ trọng được tính theo công thức sau: d = (m2 – m1): 10 (g/mL)
2.3.4. Xác định các chỉ tiêu vi sinh
Để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, phẩm màu từ cây lá Cẩm được xác định một số chỉ tiêu vi sinh. Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học
trong thực phẩm (QĐ 46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007). Các TCVN, ISO theo quy định về xét nghiệm thực phẩm, sản phẩm thực phẩm được trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Một số chỉ tiêu và phương pháp thử
STT Tên chỉ tiêu Phương pháp thử
01 TSVKHK TCVN 4884-1:2015 02 Coliform TCVN 4882:2007 03 E.coli TCVN 6846:2007 04 Cl.perfringens TCVN 4991:2005 05 B.cereus TCVN 4992:2005 06 TSBTNMM-M TCVN 8275-2:2010
2.3.5. Chiết tách và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết từ cây lá Cẩm
Cho m (g) nguyên liệu bột lá Cẩm vào V (ml) C2H5OH vào trong bình cầu đáy tròn, lắp sinh hàn hồi lưu đun nóng ở nhiệt độ toc với thời gian t (phút). Để nguội hỗn hợp dịch chiết đến nhiệt độphòng thu được dịch chiết 1 bằng vải lọc, sau đó lọc dịch chiết 1 qua giấy lọc thu được dịch chiết 2. Đểxác định hàm lượng chất màu lấy mẫu dịch chiết 2 đi đo UV- VIS ở bước sóng 664nm.
2.3.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết chưng ninh bằngetanol etanol
a. Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ rắn lỏng
Cho 1g bột nguyên liệu cây lá Cẩm vào V (ml) C2H5OH vào bình cầu đáy tròn, lắp ống sinh hàn vào bình cầu đun ở nhiệt độ 50oC ứng với 5 mẫu thí nghiệm với thể tích lần lượt là 50ml, 75ml, 100ml, 125ml, 150ml. Sau thời gian 50 phút lấy ra: đối với dung dịch trong bình cầu, lấy vải sạch lọc 3 lần, sau đó lọc thêm 3 lần với giấy lọc. Sau đó đem 5 mẫu vừa lọc được đi đo UV-Vis bước sóng 664 nm.
b. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Cho vào bình cầu: 1g lá cẩm xay và 75ml C2H5OH. Lắp ống sinh hàn tiến hành đun trong thời gian 50 phút. Khảo sát 5 mẫu với 5 nhiệt độ lần lượt là: 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC. Sau thời gian 30 phút lấy ra, lọc với 3 lần vải sau đó lọc
dung dịch thêm 3 lần với giấy lọc. Đem 5 mẫu thí nghiệm vừa lọc đo UV-Vis bước sóng 664 nm.
c. Khảo sát thời gian chiết
Cho 1g lá cẩm xay và 75ml C2H5OH vào bình cầu. Lắp ống sinh hàn tiến hành đun ở nhiệt độ 70oC với thời gian lần lượt ứng với 5 mẫu thí nghiệm là 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút, 70 phút. Sau đó đem lọc với vải 3 lần và lọc giấy lọc thêm 3 lần nữa. Các dung dịch được đo UV-Vis.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ VẬT LÝ3.1.1. Độ ẩm mẫu nguyên liệu 3.1.1. Độ ẩm mẫu nguyên liệu
Bằng phương pháp trọng lượng, độ ẩm của mẫu nguyên liệu cây lá Cẩm được xác định và tổng hợp ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của mẫu nguyên liệu cây lá Cẩm
STT G (g) G1 (g) G2 (g) %H2O
1 3,1504 32,8506 32,5243 10,3574
2 3,3732 34,7674 34,4193 10,3196
3 3,6086 31,4023 31,0325 10,2477
Độẩm trung bình (%) 10,3082
Kết quả trên Bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình trong bột mẫu nguyên liệu cây lá Cẩm là 10,3082 %. Với độ ẩm này nằm trong khoảng tiêu chuẩn bảo quản của mẫu nguyên liệu dược liệu 10 – 14%. Do vậy nguyên liệu sẽ bảo quản được trong thời gian dài và nguyên liệu sử dụng trong chiết tách có tính ổn định.
3.1.2. Xác định hàm lượng tro
Bằng phương pháp định lượng, hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định và trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm lượng tro mẫu nguyên liệu cây lá Cẩm
STT mo (g) m1 (g) m2 (g) %Htro
1 5.018 35,502 35,990 9,725
2 5.027 36,280 36,763 9,608
3 5.021 34,760 35,252 9,799
Hàm lượng tro trung bình (%) 9,711
lá Cẩm là 9,711 % là hàm lượng trung bình đối với mẫu thực vật (15- 20 %). Với hàm lượng này dựbáo hàm lượng kim loại nặng có của cây lá Cẩm là không lớn.
3.1.3. Xác định hàm lượng kim loại nặng
Hàm lượng một số kim loại nặng của cây lá Cẩm được xác định bằng phương pháp AAS. Kết quảđược thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại trong cây lá Cẩm
STT Kim loại Phương pháp thử (AAS) Kết quả (μg/l) Kết quả (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) 1 Pb TCVN 8126:2009 0,502 0,05 ≤ 2,00 2 As AOAC 986.15 KPH KPH (LOD = 0,021) ≤ 1,00 3 Cr TCVN 8126:2009 0,422 0,04 ≤ 2,00 4 Hg TCVN 7993:2009 KPH KPH (LOD = 0,013) ≤ 0,05
Bảng 3.3. thấy thành phần kim loại nặng Pb, As, Cr, Hg có của cây lá Cẩm là tương đối thấp. Đây là một trong những chỉ số quan trọng để đánh giá việc sử dụng cây lá Cẩm làm dược liệu an toàn. Vì vậy ta có thể nhận thấy là khi sử dụng cây lá Cẩm thì hàm lượng kim loại nặng không ảnh hưởng đến sức khoẻcon người.
3.1.4. Xác định tỉ trọngcủadịch chiết etanol
Chuẩn bị 5 bình cầu và lần lượt cho vào từng bình theo tỷ lệ 1g nguyên liệu/ 50ml cồn. Đun hồi lưu trên bếp cách thủy với thời gian thay đổi, nhiệt độ 80 oC. Sau khi đun xong cho 5 bình lần lượt vào từng cốc rồi ta cô cạn từng cốc để đưa thể tích10ml. Đo tỉ trọng, sử dụng bình tỉ trọng 10 ml, rửa sấy khô bình tỷ trọng , cho 10ml cồn vào bình tỷ trọng đem cân được giá trị m1
Tiếp tục rửa và sấy khô rồi cho dịch chiết vào đem cân thu được khối lượng m2. Tỉ trọng được tính theo công thức sau: d = (m2 – m1): 10 (g/mL)
Kết quả trình bày ở Bảng 3.4
Bảng 3.4. Tỉ trọng của dịch chiết theo thời gian
Thời gian m1 (gam) m2 (gam) Tỉ trọng(g/mL)
70 phút 24,60 24,67 0,007
90 phút 24,60 24,67 0,007
110 phút 24,60 24,68 0,008
130 phút 24,60 24,68 0,008
Qua bảng 3.4 cho thấy với thời gian 110 phút thì tỉ trọng không thay đổi, các chất được chiết ra xem như hoàn toàn. Sau thời gian chiết 110 phút tỉ trọng 0,008. Tương đương có có 0,008 gam cao chiết trong 1 mL dịch chiết.
3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ
3.2.1. Kết quả nghiên cứu thu dịch chiết bằng dung môi n-hexan
a. Dịch chiết n-hexan của cây lá Cẩm
Điều kiện tiến hành: Bột cây lá Cẩm 10 g, thể tích dung môi là 200 ml n-hexan; thời gian chiết: 2, 4, 6, 8 giờ. Tiến hành chiết soxhlet trên bếp cách thủy ở nhiệt độ từ khoảng 68oC - 78oC. Sau đó, tiến hành cô dung môi để thu cao chiết. Khối lượng cao chiết được trình bày trên Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu được
Thời gian chiết (giờ) 2 4 6 8
Khối lượng cao chiết (g) 0,20 0,24 0,29 0,29
Bảng 3.5 ta thấy, thời gian chiết từ 2 giờđến 8 giờ thì khối lượng cao chiết thu được có tăng theo thời gian nhưng từ 6 giờ đến 8 giờ thì khối lượng cao có tăng nhưng không đáng kể. Điều này có thể giải thích là do khi tăng thời gian chiết các chất của cây lá Cẩm không hòa tan thêm được. Vậy thời gian chiết tốt nhất là 6 giờ.
b. Định danh thành phần hóa học trong dịch n-hexan của cây lá Cẩm bằng GC-MS
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-hexan từ cây lá Cẩm được thể hiện ở Hình 3.1 và kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan được trình bày ở Bảng 3.6.
Hình 3.1. Sắc ký đồ GC – MS của dịch chiết n-hexan của cây lá Cẩm
Bảng 3.6. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan của cây lá Cẩm STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 1 6.047 6.094 Benzen, 1,2,3,5-tetramethyl- 2 6.45 5.303 Naphthalene 3 7.569 0.972 Naphthalene, 2-methyl- 4 13.28 6.231 2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl- 5 14.442 1.083 n-Hexadecanoic acid
STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 6 15.891 15.002 Phytol 7 16.181 0.842 Z-(13,14-Epoxy)tetradec-11-en-1-ol acetate 8 16.801 0.863 E-8-Methyl-9-tetradecen-1-ol aceate 9 18.008 1.412 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4-olide 10 18.405 1.043 Tetracosane 11 19.209 1.681 Heneicosane 12 19.48 36.87 Di-n-octyl phthalate 13 19.984 1.773 Pentacosane 14 20.73 1.659 Octacosane 15 21.447 0.947 Squalene 16 21.564 7.338 Heptacosane
17 22.184 0.763 1-Monolinoleoylglycerol trimethylsilyl ether 18 25.633 2.740 Campesterol
19 25.953 3.610 Stigmasterol 20 26.815 3.776 y-Sitosterol
Từ kết quảở Bảng 3.6 cho ta thấy phương pháp GC – MS đã định danh được 20 cấu tử trong dịch chiết n-hexan từ cây lá Cẩm. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan chủ yếu là những cấu tửcó độ phân cực yếu đến không phân cực, bao gồm các hidrocacbon và các acid hữu cơ tồn tại chủ yếu ở dạng tự do và este do có cấu trúc tương tự nên các cấu tử này dễ dàng phân bố vào dung môi n-hexan
Các cấu tử có hàm lượng cao như: Di-n-octyl phthalate chiếm 36,9%, thích hợp để làm mỹ phẩm, đồ chơi trẻ em vì không độc hại [15]. Phytol chiếm 15 %, chất này là tiền chất sản xuất ra các loại vitamin E và K1, nó thích hợp để làm mỹ phẩm, nước hoa, dầu gội đầu…[16]
3.2.2. Kết quả nghiên cứu thu dịch chiết cây lá Cẩm bằng dung môi clorofom
a. Dịch chiết clorofom của cây là Cẩm
Điều kiện tiến hành: 10 gam bột cây lá Cẩm, thể tích dung môi là 200ml clorofom; ta tiến hành khảo sát thời gian chiết lần lượt là 2, 4, 6, 8 giờ. Tiến hành chiết soxhlet trên bếp cách thủy ở nhiệt độ khoảng 62-72oC. Sau đó, tiến hành cô dung môi để thu cao chiết rồi đem cao chiết thu được đi cân. Kết quảđược trình bày ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu được
Thời gian chiết (giờ) 2 4 6 8
Khối lượng cao chiết (g) 0,35 0,40 0,42 0,42 Qua Bảng 3.7 ta thấy, thời gian chiết từ 2 giờ đến 8 giờ và khối lượng cao chiết thu được có tăng theo thời gian nhưng từ 6 giờ đến 8 giờ thì khối lượng cao chiết không tăng. Điều này có thể giải thích là do khi tăng thời gian chiết các chất của cây lá Cẩm không hòa tan thêm được. Vậy thời gian chiết tốt nhất dung môi clorofom là 6 giờ.
b. Định danh thành phần hóa học có trong dịch chiết clorofom của cây lá
Cẩm bằng GC-MS
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết clorofom từ cây lá Cẩm được thể hiện ở Hình 3.2 và kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết clorofom được thể hiện ở Bảng 3.8.
Hình 3.2. Sắc ký đồ GC – MS của dịch chiết clorofom từ cây lá Cẩm
Bảng 3.8. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết clorofom của cây lá Cẩm STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 1 9.38 1.071 2,5-dimethoxythiophenol
2 12.645 0.538 Acetic acid, 2-(2,2,6-trimethy-7-oxa-bicyclo[4.1.0]- hept-1-yl)-propenyl ester
3 12.761 0.577 2-cyclohexen-1-one, 4-hydroxy-3,5,5-trimethyl-4- (3-oxo-1-butenyl)-
4 13.28 3.066 2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl-