a. Dịch chiết clorofom của cây là Cẩm
Điều kiện tiến hành: 10 gam bột cây lá Cẩm, thể tích dung môi là 200ml clorofom; ta tiến hành khảo sát thời gian chiết lần lượt là 2, 4, 6, 8 giờ. Tiến hành chiết soxhlet trên bếp cách thủy ở nhiệt độ khoảng 62-72oC. Sau đó, tiến hành cô dung môi để thu cao chiết rồi đem cao chiết thu được đi cân. Kết quảđược trình bày ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu được
Thời gian chiết (giờ) 2 4 6 8
Khối lượng cao chiết (g) 0,35 0,40 0,42 0,42 Qua Bảng 3.7 ta thấy, thời gian chiết từ 2 giờ đến 8 giờ và khối lượng cao chiết thu được có tăng theo thời gian nhưng từ 6 giờ đến 8 giờ thì khối lượng cao chiết không tăng. Điều này có thể giải thích là do khi tăng thời gian chiết các chất của cây lá Cẩm không hòa tan thêm được. Vậy thời gian chiết tốt nhất dung môi clorofom là 6 giờ.
b. Định danh thành phần hóa học có trong dịch chiết clorofom của cây lá
Cẩm bằng GC-MS
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết clorofom từ cây lá Cẩm được thể hiện ở Hình 3.2 và kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết clorofom được thể hiện ở Bảng 3.8.
Hình 3.2. Sắc ký đồ GC – MS của dịch chiết clorofom từ cây lá Cẩm
Bảng 3.8. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết clorofom của cây lá Cẩm STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 1 9.38 1.071 2,5-dimethoxythiophenol
2 12.645 0.538 Acetic acid, 2-(2,2,6-trimethy-7-oxa-bicyclo[4.1.0]- hept-1-yl)-propenyl ester
3 12.761 0.577 2-cyclohexen-1-one, 4-hydroxy-3,5,5-trimethyl-4- (3-oxo-1-butenyl)-
4 13.28 3.066 2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl- 5 14.776 0.685 Hexadecanoic acid, ethyl ester 6 15.891 2.699 Phytol
7 17.572 2.049 7-Methyl-Z-tetradecen-1-ol acetate 8 18.012 0.631 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4-olide
STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 9 18.41 4.450 Teracosane 10 19.214 7.163 Heneicosane 11 19.49 48.90 Di-n-octyl phthalate 12 19.984 8.205 Pentacosane 13 20.73 6.978 Octacosane 14 21.452 4.44 Heptacosane 15 21.563 2.728 Squalene
16 22.188 2.552 1-Monolinoleoylglyxerol trimethylsilyl ether 17 25.633 0.763 Campesterol
18 25.957 1.178 Stigmasterol 19 26.815 1.33 γ-Sitosterol
Bảng 3.8 cho ta thấy phương pháp GC – MS đã định danh được 19 cấu tử trong dịch chiết clorofom từ cây lá Cẩm. Thành phần hóa học trong dịch chiết clorofom chủ yếu là những cấu tử có độ phân cực yếu đến không phân cực, bao gồm các hidrocacbon dài 21C 27C
Các cấu tửcó hàm lượng cao như: Di-n-octyl phthalate (48.9 %), Pentacosane (8,20 %), Heneicosane ( 7.163 %).
3.2.3. Kết quả nghiên cứu thu dịch chiết bằng dung môi etylaxetat
a. Dịch chiết etylaxetat trong của cây lá Cẩm
Điều kiện chiết tách: 10 gam bột cây lá Cẩm, thể tích dung môi etylaxetat là 200ml; thời gian chiết: 2, 4, 6, 8 giờ. Tiến hành chiết soxhlet trên bếp cách thủy ở nhiệt độ từ khoảng 78 - 88oC. Sau đó, tiến hành cô dung môi để thu cao chiết rồi đem cao chiết thu được đi cân. Khối lượng cao chiết được trình bày ở Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu được
Thời gian chiết (giờ) 2 4 6 8
Khối lượng cao chiết (g) 0,17 0,20 0,22 0,22
Bảng 3.9 ta thấy, thời gian chiết từ 2 giờ đến 6 giờ và khối lượng chất thu được tăng theo thời gian, sau 6 giờ thì khối lượng cao chiết đạt lớn nhất. Điều này có thể giải thích là do khi tăng thời gian chiết các chất của cây lá Cẩm không hòa tan thêm được nữa. Vậy tôi chọn thời gian chiết tốt nhất của dung môi etylaxetat là 6 giờ.
b. Định danh thành phần hóa học trong dịch chiết etylaxetat của cây lá Cẩm bằng GC - MS
Dịch chiết etylaxetat của cây lá Cẩm được xác định thành phần hóa học bằng phương pháp GC-MS. Trên sắc kí đồ nhận được sẽ có các tín hiệu peak ứng với các cấu tử được tách. So sánh thời gian lưu với thư viện phổ có thểxác định được tên chất và đo diện tích mỗi peak ta xác định được hàm lượng mỗi chất trong hỗn hợp được nhận diện.
Sắc kí đồ GC-MS của dịch chiết etylaxetat của cây lá Cẩm được thể hiện ở Hình 3.3 và kết quảđịnh danh thành phần hóa học được thể hiện ở Bảng 3.10.
Hình 3.3. Sắc ký đồ GC – MS của dịch chiết etylaxetat của cây lá Cẩm
Bảng 3.10. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết etylaxetat của cây lá Cẩm STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 1 5.413 1.132 1,2,3-Propanetriol, 1-acetate 2 5.737 0.985 2,5-Dihydroxy-1,4-dioxane, bis(tert- butyldimethylsilyl) ether
3 6.726 0.665 Hexadecanoic acid, 3-hydroxy-, methyl ester 4 8.469 0.66 Tetradecane
5 9.375 2.614 2,5-Dimethoxythiophenol
6 12.645 0.606 Acetic acid, 2-(2,2,6-trimethyl-7-oxa- bicyclo[4.1.0]hept-1-yl)-propenyl ester
STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 7 12.761 0.734 2-Cyclohexen-1-one, 4-hydroxy-3,5,5-trimethyl-4- (3-oxo-1-butenyl)- 8 13.28 5.912 2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl- 9 14.442 1.211 n-Hexadecanoic acid 10 15.891 12.82 Phytol 11 16.806 1.753 Phytol,acetate 12 18.008 1.442 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4-olide 13 18.405 1.098 Tetracosane 14 19.209 1.964 Heneicosane 15 19.48 49.23 Di-n-octyl phthalate 16 19.984 2.073 Pentacosane 17 20.73 1.979 Octacosane 18 21.447 1.132 Squalene 19 21.563 4.214 Heptacosane
20 22.184 0.793 1-Monolinoleoylglycerol trimethylsilyl ether 21 25.633 1.753 Campesterol
22 25.957 2.609 Stigmasterol 23 26.81 2.624 γ-Sitosterol
Từ kết quả ở Bảng 3.10 cho ta thấy phương pháp GC – MS đã định danh được 23 cấu tử trong dịch chiết etylaxetat từ cây lá Cẩm. Thành phần hóa học trong dịch chiết n- n-hexane chủ yếu là những cấu tửcó độ phân cực yếu đến không phân cực. Các cấu tử có hàm lượng cao như: Di-n-octyl phthalate (49.23%), 2- Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl-(5,91%), Heptacosane (4,2%) γ-Sitosterol ( 2.624%)
c. Định danh chất màu của dịch chiết etylaxetat từ cây lá Cẩm bằng HPLC và LC-MS
Dịch chiết chiết etylaxetat từ cây lá Cẩm được đo HPLC đầu dò DAD ởbước sóng 522 nm. Kết quảở Hình 3.4 cho thấy có một peak ứng với thời gian lưu
18,024 chiếm 98,173%.
Hình 3.4. Sắc kí đồ chiết etylaxetat của cây lá Cẩm
Tiến hành khảo sát trên hệ thống LC-MS với chếđộ scan giá trị m/z từ 200 đến 1200. Tín hiệu ở phút 18 trên hệ HPLC cho tín hiệu ở phút 19,169 trên hệ LC- MS, phổ khối lượng được trình bày ở Hình 3.5
Hình 3.5. Phổ khối lượng của dịch chiết etylaxetat từ cây lá Cẩm, tại phút thứ 19 trên hệ LC-MS
Hình 3.5 cho thấy có giá trị m/z = 595,4 ứng với hợp chất cyanidin - 3- rutinoside và 534,4 ứng với hợp chất cyanidin 3- malonyglucoside[14 ].
3.2.4. Kết quả nghiên cứu thu dịch chiết bằng dung môi etanol
a. Dịch chiết etanol của cây lá Cẩm
Điều kiện tiến hành: 3 gam bột cây lá Cẩm, thể tích dung môi là 150 ml etanol; thời gian chiết: 70, 90, 110, 130 phút. Tiến hành chiết soxhlet trên bếp cách thủy ở nhiệt độ từ khoảng 80oC- 90oC. Sau đó, tiến hành cô dung môi để thu cao chiết rồi đem cao chiết thu được đi cân. Kết quả khối lượng cao thu thu được là 0,20 gam. Khối lượng cao chiết được trình bày ở Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu được
Thời gian chiết (phút) 70 90 110 130
Khối lượng cao chiết (g) 0,15 0,17 0,20 0,20
Bảng 3.11 ta thấy, thời gian chiết từ 70 phút đến 130 phút khối lượng chất thu được tăng theo thời gian, sau 110 phút thì khối lượng cao chiết đạt lớn nhất. Điều này có thể giải thích là do khi tăng thời gian chiết các chất của cây lá Cẩm không hòa tan thêm được nữa. Vậy tôi chọn thời gian chiết tốt nhất của dung môi etanol là 110 phút.
b. Định danh thành phần hóa học trong dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm bằng GC - MS
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm được thể hiện ở Hình 3.6 và kết quảđịnh danh thành phần hóa học trong dịch chiết etanol được tổng hợp ở Bảng 3.12.
Hình 3.6. Sắc kí đồ GC – MS của dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm
Bảng 3.12. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết etanol của cây lá Cẩm STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 1 8.449 0.55 Dithiocarbamate,S-methyl-,N-(2-methyl-3- oxobutyl)- 2 9.365 7.257 2,5-Dimethoxythiophenol 3 9.646 1.522 Phen, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)- 4 10.038 0.78 3,5-Dimethoxy-4-hydroxybenzyl alcohol 5 10.101 0.802 2(4H)-Benzofuranone,5,6,7,7A-tetrahydro- 4,4,7a-trimethyl-, (R)- 6 10.305 1.355 2-Tertbutyl cyclohexyl
STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi propylphosphonofluoridate 7 10.595 0.84 2-Hexadecanol 8 10.673 0.907 Geranyl isovalerate 9 11.215 1.245 2-Cyclohexen-1-one, 4-(3-hydroxy-1- butenyl)-3,5,5-trimethyl- 10 11.675 1.637 1-{2-[3-(2-Acetyloxiran-2-yl)-1,1- dimethylpropyl]cycloprop-2-enyl}ethanone
11 12.63 1.715 Ppropiolic acid, 3-(1-hydroxy-2-isopropyl-5- methlcyclohexyl)-
12 12.751 5.262 2-Cyclohexen-1-one, 4-hydroxy-3,5,5- trimethyl-4-(3-oxo-1-butenyl)-
13 12.828 0.867 Tetradecane,2,6,10-trimethyl-
14 13.26 3.78 2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl- 15 14.756 2.877 Hexadecanoic acid, ethyl ester 16 15.875 25.00 Phytol 17 16.684 0.975 1-Heptatriacotanol 18 16.786 1.417 E,E,Z-1,3,12-Nonadecatriene-5,14-diol 19 17.552 1.315 17-Pentatriacontene 20 17.988 1.235 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4-olide 21 18.259 2.372 Ethanol, 2-(9_octadecenyloxy)-, (Z)- 22 18.385 1.13 Tetrapentacontane, 1,54-dibromo- 23 19.184 0.965 Heneicosane 24 19.446 16.1 Di-n-octyl phthalate 25 19.756 1.052 E-8-Methyl-9-tetradecen-1-ol acetate 26 19.954 0.862 Phen-1,4-diol, 2,3-dimethyl-5-trifluoromethyl- 27 20.701 0.767 Octacosane
STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) Tên gọi 28 21.418 0.442 Heptacosane 29 21.534 2.91 Squalene
30 22.149 0.36 1-Monolinoleoylglycerol trimethylsilyl ether 31 25.574 2.55 Campesterol
32 25.894 4.772 Stigmasterol 33 26.751 4.507 γ –Sitosterol
Bảng 3.12 cho ta thấy phương pháp GC – MS đã định danh được 33 cấu tử trong dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm. Thành phần hóa học trong dịch chiết etanol chủ yếu là những cấu tửcó độ phân cực yếu đến không phân cực. Các chất có hàm lượng cao như: Phytol (25 %), 2,5-Dimethoxythiophenol (7,257 %)
c. Định danh chất màu của dịch chiết etanol của cây lá Cẩm bằng HPLC và LC-MS
Dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm được đo HPLC đầu dò DAD ở bước sóng 522 nm. Kết quả ở Hình 3.7 cho thấy có 3 peak ứng với thời gian lưu 10,748 (chiếm 18,779%); 12,976 ( chiếm 18,1388%); 13,716 ( chiếm 63,6833%).
Tiến hành khảo sát trên hệ thống LC-MS với chế độ scan giá trị m/z từ 200 đến 1200. Trên hệ HPLC cho tín hiệu ở phút 10,748; 12,976; 13,726 cho tín hiệu tương ứng trên hệ LC-MS ở phút 10,498; 12,818; 13,936. Phổ khối lượng được trình bày ở Hình 3.8, 3.9, 3.10.
Hình 3.8. Phổ khối lượng của dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm, tại phút thứ 10,748 trên hệ LC-MS
Hình 3.9. Phổ khối lượng của dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm tại phút thứ 12,818 trên hệ LC-MS
Kết quả Hình 3.10 Phổ khối lượng của dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm, tại phút thứ 13,936 trên hệ LC-MS cho thấy có giá trị m/z = 594,7 ứng với hợp chất cyanidin - 3-rutinoside [14].
Hình 3.10. Phổ khối lượng của dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm tại phút thứ 13,936 trên hệ LC-MS
Nhận xét chung
Bằng phương pháp GC-MS, một số thành phần hóa học trong các dịch chiết từ cây lá Cẩm đã được xác định. Tổng số cấu tử trong dịch chiết là 85 cấu tử. của cây lá Cẩm từ: n-hexane có 20 cấu tử, clorofom có 19 cấu tử, etyl axetat có 23 cấu tử, etanol có 33 cấu tử. Trong đó, dịch chiết bằng etanol của cây lá Cẩm là nhiều cấu tử nhất chứa 33 cấu tử. Như vậy, trong cùng điều kiện thực nghiệm ở phòng thí nghiệm các dung môi chiết được các chất khác nhau có thể do chúng có độ phân cực khác nhau.
Bằng phương pháp HPLC kết hợp LC-MS chứng tỏ có hợp chất màu anthocyanin trong dịch chiết: 2 chất trong dịch chiết etylaxetat là hợp chất cyanidin
- 3-rutinoside và hợp chất cyanidin - 3- malonyglucoside, 1 chất trong dịch chiết etanol là hợp chất cyanidin - 3-rutinoside [14].
Cây lá Cẩm được sử dụng chủ yếu làm phẩm màu thực phẩm trong sản xuất các loại xôi, đông sương, chè, kẹo dẻo…do vậy để thực hiện theo hướng nghiên cứu ứng dụng này chúng tôi sử dụng cồn thực phẩm làm dung môi chiết tách phẩm màu từ cây lá Cẩm.
3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHIẾT PHẨM MÀU TỪ LÁ CẨM BẰNG ANCOL ETYLIC
3.3.1. Xác định bước sóng hấp thụ cực đại:
Cho 1g lá Cẩm xay và 50 ml C2H5OH vào bình cầu. Lắp ống sinh hàn tiến hành đun ở nhiệt độ 50oC với thời gian thí nghiệm là 30 phút. Sau đó đem lọc với vải 3 lần và lọc giấy lọc thêm 3 lần nữa. Dung dịch được đo UV-Vis. Xác định bước sóng cực đại.
Hình 3.11. Phổ UV-VIS của dịch chiết etanol từ cây lá Cẩm
Hình 3.11 cho thấy bước sóng hấp thụ cực đại là 664 nm, mật độquang đạt 0,884. Chọn bước sóng λmax = 664 nm để nghiên cứu các yếu tố tiếp theo
Cho 1g lá Cẩm và V (ml) C2H5OH cho vào bình cầu, lắp ống sinh hàn vào bình cầu: tiến hành đun, nhiệt độ 50oC ứng với 5 mẫu thí nghiệm với thể tích lần lượt là 50ml, 75ml, 100ml, 125ml, 150ml. Sau thời gian 50 phút lấy ra: đối với dung dịch trong bình cầu, lấy vải sạch lọc 3 lần, sau đó lọc thêm 3 lần với giấy lọc. Sau đó đem 5 mẫu vừa lọc được đi đo UV-Vis bước sóng 664 nm. Kết quả trình bày ở Hình 3.12 và Bảng 3.13
Hình 3.12. Phổ UV-VIS khảo sát tỷ lệ rắn – lỏng của dung dịch chiết từ cây lá Cẩm Bảng 3.13. Kết quả mật độ quang khảo sát tỷ lệ rắn – lỏng của dung dịch chiết của
cây lá Cẩm
Loại mẫu 1 2 3 4 5
Mật độ quang 0,790 0,759 0,455 0,280 0,223
Bảng 3.13 cho thấy tỉ lệ rắn lỏng là 1: 50 thì mật độquang thu được lớn nhất vì ở tỉ lệ này hầu như chất tan đã được trích li tương đối cao, thể tích dung dịch nhỏ suy ra nồng độ lớn nhất do đó mật độ quang cao nhất. Khi tỉ lệ rắn lỏng là 1: 75 thì một độ quang có giảm ít so với tỉ lệ 1: 50, tuy nhiên sự giảm ởđây không quá nhiều
600.0 620 640 660 680 700.0 0.00 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00 nm A Mẫu 1 Mẫu 3 Mẫu 2 Mẫu 4 Mẫu 5 0.79004 0.45489 0.75876 0.28057 0.22307
so với sựtăng thể tích (thể tích tăng 1,5 lần, mật độ quang chỉ gảm còn 0,96 lần so vơi ban đầu). điều này cho thấy với tỉ lệ rắn lỏng 1: 75 thì sự trích li là hoàn toàn nhất, chiết được nhiều chất nhất. Chọn tỉ lệ rắn lỏng là 1: 75 để nghiên cứu các yếu tố tiếp theo
3.3.3. Khảo sát nhiệt độ
Cho vào bình cầu: 1g lá cẩm xay và 75ml C2H5OH. Lắp ống sinh hàn tiến hành đun trong thời gian 50 phút. Khảo sát 5 mẫu với 5 nhiệt độ lần lượt là: 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC. Sau thời gian 30 phút lấy ra, lọc với 3 lần vải sau đó lọc dung dịch thêm 3 lần với giấy lọc. Đem 5 mẫu thí nghiệm vừa lọc đo UV-Vis bước sóng 664 nm.
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát nhiệt độ của dung dịch chiết từ cây lá Cẩm
Loại mẫu 1 (40oC ) 2 (50oC ) 3 (60oC ) 4 (70oC ) 5 (80oC )
Mật độ quang 0,849 0,904 1,126 1,227 1,237
Hình 3.13. Phổ UV-VIS khảo sát nhiệt độ của dung dịch chiết từ cây lá Cẩm
620.0 640 660 680 700.0 0.06 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.56 nm A Mẫu 5 Mẫu 4 Mẫu 3 Mẫu 2 Mẫu 1 0.84925 0.90408 1.1255 1.2451 1.2373
Kết quả trình bày ở Hình 3.13 cho thấy khi nhiệt độ tăng thì mật độ quang tăng. Khi nhiệt độtăng độ nhớt giảm, chuyển động của các phân tử ancol tăng dần. Dưới tác dụng của nhiệt độ protopectin không tan chuyển thành pectin tan. Vì vậy ancol sẽ thẩm thấu nhanh vào bên trong tế bào cây lá Cẩm làm cho diện tích tiếp