a. Chiết nhờ siêu âm (Ultrasound-assisted extraction)
Nguyên liệu được trộn với dung môi thích hợp rồi chiết bằng siêu âm. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng siêu âm có khảnăng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, do đó giúp cho xâm nhập của dung môi vào bên trong tế bào dễdàng hơn. Ngoài ra, siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi, do đó gia tăng sự tiếp xúc của dung môi với chất cần chiết và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết.
b. Chiết siêu tới hạn (SFE: Supercritical Fluid Extraction)
Đây là phương pháp chiết được quan tâm nhiều nhất hiện nay trong lĩnh vực chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu tự nhiên nhằm ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm. Phương pháp này cho phép tự động hóa quá trình chiết và hạn chế việc sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại. Dung môi chiết là một chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn. Ở trạng thái này, chất lỏng có những tính chất đặc biệt như có tính chịu nén cao, khuếch tán nhanh, độ nhớt và sức căng bề mặt thấp… Do đó, nó có khả năng khuếch tán mạnh vào nền nguyên liệu tốt hơn nhiều so với các dung môi thông thường, vì thế làm tăng hiệu suất chiết lên nhiều lần. Trong phương pháp này, thường dùng CO2 trạng thái siêu tới hạn làm dung môi chiết (đôi khi trộn với vài % dung môi phân cực nào đó như etanol, 2-propanol để làm tăng khả năng hòa tan carotenoid của CO2) do nó cho phép chiết nhanh, chọn lọc, không làm oxy hóa carotenoit và an toàn trong vận hành.
c. Chiết dung môi tăng tốc (ASE: Accelerated Solvent Extraction) hay chiết dưới áp suất cao (PFE: Pressurized Fluid Extraction)
Đây cũng là một phương pháp chiết mới, cho phép chiết rất nhanh, tự động hóa, hiệu quả và tiết kiệm dung môi. Nguyên tắc của nó tương tựnhư phương pháp chiết Soxhlet cổ điển, ngoại trừ việc quá trình chiết được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao (nhưng vẫn dưới điểm tới hạn của dung môi sử dụng). Trong phương pháp ASE, nguyên liệu cần chiết được xay nhỏ, làm khô (thường là đông khô), rồi nhồi vào một ống chiết (extraction cell). Ống chiết này được đặt trong lò duy trì ở nhiệt độ thích hợp (có thểđiều chỉnh từ 40 – 200oC). Dung môi được bơm vào ống chiết
và giữở áp suất 10 -20 MPa trong vài phút (static time), sau đó dịch chiết được đẩy vào một bình hứng bằng một thể tích dung môi mới (flush volume). Quá trình được lặp lại vài lần (cycles). Cuối cùng, toàn bộ dịch chiết được đẩy ra bằng một dòng khí trơ (N2).
1.5. LÝ THUYẾT CHUNG VỀ PHƯƠNG PHÁP SO MÀU
Một trong những kĩ thuật phân tích hữu hiệu nhất trong sinh học là phương pháp so màu. Trong phương pháp này, nồng độ của các hợp chất màu được xác định bằng cách đo cường độ màu của dung dịch chứa hợp chất đó. Các phương pháp đo quang phổthường được đo trong dãy bước sóng 200 nm - 800 nm. Dãy quang phổ này được chia thành 3 vùng: vùng tử ngoại (200 nm - 400 nm), vùng khả kiến (396 - 760 nm), vùng hồng ngoại (800 - 2000 nm). Trong đó vùng hồng ngoại rất ít được sử dụng trong hóa sinh, vùng khả kiến được sử dụng trong phương pháp phân tích so màu [1].
Khi dòng ánh sáng trắng xuyên qua dung dịch màu thì chỉ có các bước sóng nhất định sẽ bị hấp thụ và những bước sóng khác hầu như không bị hấp thụ và màu của dung dịch mà ta nhìn thấy chính là màu của các bước sóng không bị hấp thụ (Bảng 1.3).
Cường độ màu của dung dịch có thể được xác định bằng cách đo cường độ ánh sáng hấp thụ bởi hợp chất màu có trong dung dịch. Vì dùng ánh sáng trắng để đo cường độ màu, nên ánh sáng hấp thụ cách càng xa càng tốt những bước sóng không hấp thụ bởi dung dịch màu, vì vậy tốt nhất là nên dùng ánh sáng đơn sắc [3].
Bảng 1.6. Tính chất màu của dung dịch trong vùng ánh sáng trắng
Ánh sáng trắng tới Ánh sáng hấp thụ không hÁnh sáng ấp thụ dung dMàu củịch a
Ánh sáng trắng
Vàng và xanh da
trời Đỏ Đỏ
Xanh da trời Đỏ và vàng Da cam Xanh da trời và đỏ Vàng Vàng
Đỏ Vàng và xanh da trời Xanh lá cây Đỏ và vàng Xanh da trời Xanh da trời Vàng Xanh da trời và đỏ Tím
Phương pháp phân tích đo màu dựa vào định luật Lambert- Beer
Nguyên tắc
Khi ta chiếu một chum sáng đơn sắc có cường độ Io vào một cuvet chứa dung dịch mẫu có độ dài l thì một phần chùm sáng đi qua cuvet, một phần phản xạ và tán xạra các phương do va đập vào thành cuvet và một phần bị các phân tử trong cuvet hấp thụ. Trong đó, phần hấp thụ bởi các phân tử chất màu trong cuvet là chính [4].
Nếu sau khi đi qua cuvet cường độ ánh sáng còn là I thì ta có sự hấp thụ ánh sáng đơn sắc của các phân tửtrong cuvet được biểu diễn bởi công thức:
D = log = .L.C Trong đó:
: Hệ số hấp thụ phân tử (L.mol-1.cm-1) L: chiều dài cuvet (cm)
C: nồng độ của chất hấp thụ (mol/L)
Màu của dung dịch là do sự hấp thụkhông đồng đều các vùng khả kiến, khi có tia sáng đi qua dung dịch màu, không phải tất cả các tia phổđều bị hấp thụ với mức độ giống nhau, có phần tia hầu như không bị hấp thụ. Mỗi dung dịch màu của các hợp chất khác nhau có đường cong hấp thụ khác nhau hay có phổ hấp thụ khác nhau. Để có đường cong hấp thụ người ta tiến hành đo mật độ quang học của dung dịch màu đó ởcác bước sóng khác nhau và độ dài của bước sóng từ 400 nm (tím) – 700 nm (đỏ) [5].
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu mẫu nghiên cứu là cây lá Cẩm xay, Cây lá Cẩm thu mua tại mua tại chợ Thiết Quận 11 thành phố Hồ Chí Minh.
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
a. Hóa chất
- Cồn 96% (C2H5OH ) (Việt Nam), cloroform (Merck), n-hexan (Trung Quốc), etylaxetat (Trung Quốc), etanol (Merck).
b. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Thiết bị đo sắc ký khí ghép phổ khối (GC- MS) của Trung tâm Chất lượng Nông lâm Thủy sản Vùng 2.
- Thiết bị đo (HPLC), (AAS) của Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh Thực phẩm khu vực miền Trung - Viện Pasteur Nha Trang.
- Máy đếm khuẩn lạc, tủ an toàn sinh học, tủấm tại Trung tâm Y tế Dự phòng Quảng Nam.
- Máy UV – VIS của khoa Hóa, Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
- Máy sấy phun mini – B290 – Standard mini spray dryver của Trường Cao đẳng Lương thực - Thực phẩm, quận Sơn Trà- TP. Đà Nẵng.
- Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, máy đo pH, bộ soxhlet, bộ chưng ninh. Các dụng cụ thí nghiệm khác như: cốc thủy tinh, bình tam giác, chén sứ, ống nghiệm, bếp cách thủy, pipet, bình định mức, nhiệt kế, bình hút ẩm, giấy lọc…
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1. Phương pháp trọng lượng 2.2.1. Phương pháp trọng lượng
Độ ẩm và hàm lượng tro của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp trọng lượng.
2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)
a. Sự xuất hiện của phổ hấp thụ nguyên tử
Nếu ta chiếu một chùm tia sáng có bước sóng xác định vào đám hơi nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạcó bước sóng ứng đúng với những tia bức xạ mà có thể phát ra được trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử.
Nghiên cứu sự phụ thuộc cường độ một vạch phổ hấp thụ của một nguyên tố vào nồng độ C của nguyên tố đó trong mẫu phân tích, người ta rút ra được kết luận sau: Trong một vùng nồng độ nhỏ, mối quan hệ giữa cường đồ vạch hấp thụ và số nguyên tử của các nguyên tốđó trong đám hơi cũng tuân theo định luật Lambert – Beer .
D = C.L
b. Nguyên tắc của phép đo phổ hấp thụ nguyên tử
Trong điều kiện bình thường, nguyên tử không hấp thụhay phát ra năng lượng dưới dạng các bức xạ. Lúc này nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản, đó là trạng thái năng lượng bền vững và nghèo năng lượng nhất của nguyên tử. Nhưng khi ở trạng thái hơi nguyên tử tự do, nếu ta chiếu một chùm tia sáng có những bước sóng (tần số) xác định vào đám hơi nguyên tử đó thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạcó bước sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thểphát ra được trong quá trình phát xạ. Lúc đó nguyên tửđã nhận năng lượng dưới dạng các tia bức xạ và nó chuyển lên trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn trạng thái cơ bản. Quá trình đó được gọi là quá trình hấp thụ năng lượng nguyên tử. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử [7].
Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử, đám hơi nguyên tử mẫu trong ngọn lửa hay trong cuvet graphit là môi trường hấp thụ bức xạ. Phần tử hấp thụ năng lượng muốn có phổ hấp thụ nguyên tửthì trước hết phải tạo ra được đám hơi nguyên tử tự do và sau đó, chiếu vào nó một chum tia sáng có những bước sóng xác định ứng đúng với các tia phát xạ của nguyên tố cần nghiên cứu. Khi đó các nguyên tử tự do sẽ hấp thụnăng lượng và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử của nó.
2.2.3. Phương pháp so màu
tối ưu của quá trình chiết.
2.2.4. Phương pháp phân tích và định danh thành phần hóa học của các dịch chiết dịch chiết
Trong luận văn này, tôi phân tích và định danh thành phần hóa học các dịch chiết n- n-hexane, clorofom, etyl axetat, etanol từ cây lá Cẩm bằng phương pháp đo sắc kí khí ghép phổ khối (GC-MS), sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc kí lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC-MS).
► Phương pháp GC - MS dựa trên cơ sở “nối ghép” máy sắc kí khí (Gas Chromatography) với máy khối phổ (Mass Spectometry).
Hệ thống sắc kí khối phổ là một detector khối phổ được ghép nối với thiết bị sắc kí khí nối với nhau qua bộ kết nối nhằm mục đích loại bớt khí mang như N2, He để giảm áp suất của dòng khí mang và phân tử mẫu chất đi vào buồng ion hóa của khối phổ. Phần thiết bị sắc kí dùng làm mao quản, phần phổ khối sử dụng buồng ion hóa và bộ tách từ cực và detector khối phổ.
Sau khi đi qua các cột sắc kí khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. Ở đây chúng bị ion hóa. Sau khi đi qua khối phổ chúng sẽ tới bộ phận lọc, dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua.
Thiết bị cảm biến có nhiệm vụđếm sốlượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau đó chuyển đến máy tính và xuất kết quả gọi là khối phổ. Khối phổ là một biểu đồ phản ánh sốlượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc.
+ Xác định công thức phân tử, dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị xuất hiện trên phổđồ.
+ Xác định công thức cấu tạo: dựa vào giá trị m/e, cường độ tương đối giữa các ion phân tửcũng như ion màng.
+ Định lượng thành phần nguyên tố của ion cần xác định.
► Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn
hợp mẫu, qua một cột sắc ký. Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn. Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tớisự phân tách các thành phần khí mà chúng chảy ra khỏi cột. HPLC được phân biệt với sắc ký lỏng truyền thống áp suất thấp bởi vì áp suất hoạt động của nó cao hơn nhiều (50-350 bar), trong khi sắc ký lỏng thông thường chỉ dự trên lực hút trái đất để pha động đi qua cột. Do chỉ có một lượng nhỏ mẫu được tách bằng phân tích HPLC, cột có kích thước 2.1-4.6 mm cho đường kính và 30–250 mm cho chiều dài. Cột HPLC cũng đổ với kích thước hạt hấp phụ nhỏ hơn (trung bình kích thước hạt 2-50 micro mét). Điều này mang lại HPLC hiệu quả phân giải cao (khả năng táchbiệt từng chất) khi mà tách hỗn hợp, làm cho nó trở thành phương pháp sắc ký phổ biến. Sơ đồ của một thiết bị HPLC đặc thù gồm có cổng lấy mẫu, bơm, và một đầu dò. Cổng lấy mẫu đưa hỗn hợp mẫu và dòng pha động để đi qua cột. Hệ thống bơm đảm bảo tốc độ dòng mong muốn và thành phần của qua động qua cột. Đầu dò tạo ra tín hiệu tỷ lệ với lượng mẫu thành phần đi ra từ cột, do đó cho phép phân tích định lượng của những thành phần trong mẫu. Một bộ vi xử lý số và phần mềm điều khiển thiết bị HPLC và cung cấp dữ liệu phân tích. Một vài mẫu bơm cơ trong thiết bị HPLC có thể trộn nhiều dung môi với nhau trong những tỉ mà thay đổi theo thời gian, tạo ra thành phần gradient trong pha động. Các đầu dò như UV/Vis, PDA hay khối phổ được sử dụng phổ biến. Phần lớn các thiét bị HPLC có lò cột để điều chỉnh nhiệt độ phân tách. Hỗn hợp mẫu để phân tích và tách có thể tích rất nhỏ được đưa vào dòng pha động đang thấm qua cột. Những thành phần của mẫu đi qua cột với tốc độ khác nhau, đây là chức năng của những tương tác vật lý cụ thể với chất hấp phụ của cột (còn gọi là pha tĩnh). Tốc độ của từng thành phần phụ thuộc vào bản chất hoá học tự nhiên nó trên pha tĩnh và thành phần của pha động. Thời gian mà một chất phân tích rửa giải ra khỏi cột gọi là thời gian lưu. Thời gian lưu được đo trong những điều kiện đặc trưng và được xem là đặc điểm nhận biếtcủa chất đem phân tích.
Có nhiều loại cột khác nhau, được làm bằng những chất hấp phụ có kích thước hạt và bề mặt tự nhiên thay đổi. Việc sử dụng những vật liệu có hạt có kích thước nhỏ
hơn đổ cột yêu cầu áp suất hoạt động cao hơn và điển Hình cải thiện độ phân giải sắc ký (mức độ phân tách giữa những chất phân tích đi ra từ cột nối tiếp nhau). Xét về bề mặt hóa học, những hạt hấp phụ có thể có cực hay không cực. Các pha động thường được sử dụng bao gồm sự kết hợp có thể trộn lẫn của nước với dung mỗi hữu cơ khác nhau (phổ biến nhất là acetonitrile và methanol). Một số kỹ thuật HPLC sử dụng dung môi không nước. Thành phần nước trong pha động có thể có axít (axít formic, photphoric hay trifluoroacetic) hoặc muối để hỗ trợ sự phân tách các thành phần mẫu. Thành phần pha động có thể được giữ cố định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi (rửa giải gradient) trong quá trình phân tích sắc ký. Rửa giải đẳng dòng đặc biệt hiệu quả trong phân tách những thành phần mẫu không khác nhau nhiều về ái lực của chúng với pha động. Với rửa giải gradient thành phần của pha động được thay đổi từ thấp tới cao để tăng sức rủa giải. Sức rửa giải của pha động được phản ánh bằng thời gian lưu của mẫu, sức rửa giải cao thì thời gian lưu của mẫu ngắn.
►LC-MS
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó. Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu