2.1.1. Nguyên liệu
Củ nghệ vàng - Tên khoa học: Curcuma longa Linneaus.
Tên thuốc : Rhizoma Curcumae longae
Bộ Gừng : Zingiberales
Họ Gừng : Zingiberaceae
Chi : Curcuma
Ngành : Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp : Hành ( Liliopsida)
Phân Lớp : Thài Lài (Commelinidae)
Hình ảnh cây, củ nghệ vàng dùng làm nguyên liệu được thể hiện ở hình 2.1.
Nguyên liệu mua về chứa nhiều tạp chất. Tạp chất chủ yếu trong nguyên liệu là tạp chất rắn (như đá, sỏi, đất,…) và tạp chất hữu cơ (xơ, lá khô, thân cây, rác,…). Cần phải rửa sạch bằng nước. Sau đó xắt lát và tiến hành chưng cất lấy tinh dầu.
Sau khi chưng cất lấy tinh dầu, để nguyên liệu trong cốc thủy tinh và hong trên bếp điện cho ráo bớt nước rồi bỏ vào chậu thủy tinh sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ
600C, khoảng 12 giờ thì nghệ khô, sau đó được đem đi xay bằng máy xay sinh tố,
rây, và dùng để chiết trong các dung môi.
2.1.2. Thiết bi ̣ – du ̣ng cu ̣
Máy đo quang phổ hấp thu ̣ nguyên tử AAS, máy đo sắc kí lỏng cao áp HPLC
(Công ty dược DANAPHA), máy đo GC/MS (Trung tâm kỹ thuâ ̣t đo lường chất lượng II, số 2 Ngô Quyền, Đà Nẵng).
Tủ sấy, bộ chiết Shoxlet 500ml, bộ chưng cất tinh dầu nhẹ hơn nước, dụng cụ phòng thí nghiệm thông thường: cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, phểu, giấy lọc, cân phân tích....
2.1.3. Hó a chất
- Nước cất, Etyl axetat, metanol, axeton, n-hexan, ete dầu hỏa, cồn tuyệt đối, KOH, phenolphtalein...
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định một số chỉ số vật lý
2.2.1.1. Độ ẩm củ nghệ tươi
Cơ sở lý thuyết
Xác định độ ẩm, hàm lượng tro dựa trên phép phân tích trọng lượng đây là phương pháp phân tích định lượng dựa vào kết quả cân khối lượng của sản phẩm, hình thành sau phản ứng kết tủa bằng phương pháp hoá học hay bằng phương pháp vật lý. Do chất phân tích chiếm một tỷ lệ xác định trong sản phẩm đem cân nên dựa vào khối lượng của sản phẩm đem cân dễ dàng suy ra lượng chất phân tích trong đối tượng phân tích.
Ưu điểm: Các phương pháp phân tích trọng lượng cho phép ta xác định được
tới độ chính xác cao hàm lượng của các cấu tử riêng biệt trong một mẫu đã cho của chất phân tích, hoặc nồng độ của chúng trong dung dịch. Phân tích trọng lượng được dùng để xác định rất nhiều kim loại (các cation) và các phi kim ( các anion), các thành phần của hợp kim, của các quặng Silicat, các hợp chất hữu cơ....Bằng phân tích trọng lượng, người ta tiến hành xác định với độ chính xác đạt tới 0,01- 0,005%, độ chính xác đó vượt xa độ chính xác của các phương pháp chuẩn độ.
Nhược điểm: Nhược điểm chủ yếu của phân tích trọng lượng là thời gian xác
định kéo dài, dài hơn nhiều so tới thời gian phân tích khi thực hiện các phương pháp phân tích chuẩn độ. Vì nguyên nhân này mà các phương pháp phân tích trọng lượng bị mất đi giá trị trước kia của mình và trong thực tiễn người ta thay thế bằng các phương pháp phân tích hoá học và hoá lý hiện đại nhanh hơn nhiều.
Tiến hành
Chuẩn bị 5 chén sứ, rửa sạch, đánh số, sấy khô trong tủ sấy ở 600C . Đặt vào
bình hút ẩm, làm nguội đến nhiệt độ phòng, đem cân la ̣i đến khối lượng không đổi
m0. Mẫu để xác đi ̣nh đô ̣ ẩm là mẫu tươi và lấy ngẫu nhiên. Cân lượng mẫu chính
xác 5 gam nghệ tươi xắt lát, cho vào chén sứ, cân lại trên cân phân tích được khối
lượng m1 cho vào các chén sứ đã được chuẩn bi ̣ sẵn và được sấy ở nhiê ̣t đô ̣ trên. Cứ
sau 2 giờ la ̣i lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguô ̣i đến nhiê ̣t đô ̣ phòng rồi cân (nếu
cân khi còn nóng thì mẫu sẽ hút hơi nước của không khí), đến khi khối lượng mẫu
và cốc không đổi được khối lượng m2.
Độ ẩm của mỗi mẫu là hiê ̣u số giữa khối lượng mẫu trước và sau khi sấy.
W = m1- m2. W là lượng nước đã bay hơi.
Hàm lượng % ẩm được tính theo công thức:
1 2 W m m 100% (%) m
Độ ẩm của mẫu là trung bình cộng của 3 mẫu.
Trong đó: m1: Khối lượng chén sứ và nguyên liệu (g).
m2: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g). W (%): độ ẩm của mỗi mẫu.
2.2.1.2. Hàm lượng tro trong củ nghệ tươi
Để xác đi ̣nh hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể đô ̣ng, thực
vật người ta thường dùng các phương pháp tro hóa mẫu.
Các mẫu (khối lượng m) đã xác đi ̣nh đô ̣ ẩm ở trên tiếp tu ̣c được sử du ̣ng để
tro hóa. Mẫu được đun trên bếp điê ̣n, than hóa sơ bô ̣, sau đó cho vào lò nung và tiến
hành tro hóa mẫu ở nhiê ̣t đô ̣ 500 – 5500C trong thờ i gian khoảng 8 tiếng cho đến khi
thu được tro trắng.
Lấy mẫu ra làm nguô ̣i đến nhiê ̣t đô ̣ phòng trong bình hút ẩm, cân la ̣i mẫu
đến khối lượng không đổi, có khối lượng m3.
Khối lượng tro được tính là: m4 = m3 – m0
m4: khối lượng tro
m3: khối lượng chén và mẫu sau khi tro hóa
m0: khối lượng chén sứ
2.2.1.3. Hàm lượng kim loại có trong củ nghệ vàng bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS phổ hấp thụ nguyên tử AAS
Cơ sở lý thuyết
Phép đo phổ hấp thu ̣ nguyên tử (AAS) là mô ̣t kỹ thuâ ̣t phân tích tương đối
mớ i đã và đang được phát triển ma ̣nh mẽ và ứng du ̣ng rô ̣ng rãi trong nhiều lĩnh vực
khoa học và kỹ thuâ ̣t. Đối tượng của phương pháp phân tích của phổ hấp thụ
nguyên tử là lượng nhỏ các kim loa ̣i và mô ̣t số á kim trong rất nhiều đối tượng mẫu
như quă ̣ng, đất, nước khoáng, các mẫu sinh ho ̣c, y ho ̣c, các sản phẩm nông nghiê ̣p, thực phẩm… quá trình phân tích có thể thực hiện khá đơn giản, nhanh chóng.
Cơ sở lý thuyết của phép đo là dựa vào khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ cộng hưởng của nguyên tử ở trạng thái tự do. Đối với mỗi nguyên tố vạch cộng hưởng thường là vạch quang phổ nhạy nhất của phổ phát xạ nguyên tử của chính nguyên tử đó. Thông thường thì khi hấp thụ bức xạ cộng hưởng, nguyên tử sẽ chuyển từ trạng thái ứng với mức năng lượng cơ bản sang mức năng lượng cao hơn
ở gần mức năng lượng cơ bản nhất, thường gọi là bước chuyển cộng hưởng. Tiến hành:
Mẫu sau khi than hoá thì hòa tan bằng 5 ml axit nitric đặc. Sau đó thêm một ít nước cất vào, lắc kỹ và lọc để loại tạp chất. Sau đó cho vào bình định mức 25 ml và thêm nước cất đến vạch, ta thu được dung dịch cần phân tích. Hàm lượng một số kim loại được xác định tại Trung tâm khí tượng thủy văn quốc gia – Khu vực miền trung , số 666- Trưng Nữ Vương, Thành phố Đà Nẵng.
2.2.2. Chiết tách tinh dầu, xác định thành phần hóa học
Cơ sở lý thuyết
Có thể tách tinh dầu bằng nhiều phương pháp như dùng dung môi hữu cơ để chưng ninh hoặc chiết Sohxlet, ép, trích ly, chưng cất lôi cuốn hơi nước, phương pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định. Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo thì khi chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn.
Phương pháp này có quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản, thiết bị gọn, dễ chế tạo, không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ, thời gian tương đối nhanh. Tuy nhiên không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp, chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bị phân hủy, không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu (đó là những chất định hương thiên nhiên rất có giá trị).
Tỉến hành
Chúng tôi thu tinh dầu nghệ bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, mỗi lần dùng khoảng 150g nguyên liệu tươi, đổ nước đến khoảng 2/3 bình cầu, dung tích bình cầu 1 lit, dùng bộ chiết tinh dầu nhẹ hơn nước. Lắp dụng cụ như hình
giờ), kết thúc quá trình chưng cất, thay bình cầu mới có chứa mẫu mới. Tinh dầu
được làm khan bằng Na2SO4, và giữ mát trong tủ lạnh trước khi xác định các chỉ số
hóa lý và thành phần hóa học.
Tinh dầu được phân tích và xác định thành phần bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ tại Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng II, số 2 Ngô Quyền. Đà Nẵng.
Hình 2.2. Dụng cụ chưng cất tinh dầu 2.2.3. Xác định các chỉ số hóa học
2.2.3.1.Chỉ số axit
Định nghĩa : Chỉ số axit được định nghĩa là số mg KOH cần dùng để trung
hòa các axit tự do có trong 1g tinh dầu. Cách tiến hành:
Cân 1g tinh dầu không lẫn nước, cho thêm 10ml etanol trung tính, nhỏ vài giọt phenolphtalein vào. Chuẩn độ bằng dung dịch KOH có nồng độ 0,913N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền vững.
Chỉ số axit được tính theo công thức: Ax = 56.C .VN
m Trong đó: V: Số ml KOH 0,0913 N đã dùng
m: Khối lượng tinh dầu đem trung hòa (g)
CN: Nồng độ dung dịch KOH
2.2.3.2 .Chỉ số este
Định nghĩa : Chỉ số este là số mg KOH xà phòng hoá hết lượng este có trong 1g tinh dầu.
Cách tiến hành:
Sử dụng mẫu đã xác định chỉ số axit ở trên, thêm chính xác 20ml dung dịch KOH 0,0913 N trong etanol. Lắp ống sinh hàn ngược vào bình và đun trong bếp cách thuỷ, đến khi phản ứng xà phòng kết thúc (khoảng 1 giờ, lúc đó dung dịch trong bình vẫn trong suốt và đồng đều, không biến đổi khi pha loãng với nước).Thí nghiệm được mô tả ở hình 2.3.
Cũng cùng một lúc song song với mẫu kiểm tra, làm một mẫu trống tương tự với 20 ml KOH 0,0913N trong etanol và 10ml etanol, tiến hành trong cùng điều kiện như trên, sau khi phản ứng xảy ra xong, cho vào cả hai mẫu mỗi bình 5 giọt chỉ thị màu phenolphtalein 0,2% và chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1N.
Hiệu số giữa số ml dung dịch HCl 0,01N đã dùng trong mẫu trắng và số ml đã dùng trong mẫu thử là số ml dung dịch KOH 0,01N đã dùng để xà phòng hoá các este có trong chất cần thử. Chỉ số este tính bằng công thức: S 56 ( 2 1).0,1 E m V V
Trong đó m: Số gam tinh dầu.
V1: Thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng chuẩn độ mẫu thí nghiệm (ml).
V2 : Thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng chuẩn độ mẫu trắng (ml).
2.2.3.3. Chỉ số xà phòng hóa
Chỉ số xà phòng hóa là số miligam KOH cần thiết để trung hòa các axit tự do và xà phòng hóa este chứa trong 1 gam tinh dầu.
Như vậy: Chỉ số xà phòng hoá bằng tổng chỉ số axit và chỉ số este.
2.2.3.4. Tỷ khối của tinh dầu nghệ
Định nghĩa: Tỷ khối của chất là tỷ lệ của khối lượng (m) đối với thể tích (V)
của chất: d = (g/cm3)
V m
Thông thường xác định tỷ khối tương đối d là tỷ khối của chất cần xác định so với tỷ khối của chất khác ở cùng điều kiện xác định:
d = m m m m 1 2 Trong đó d: tỉ khối
m : khối lượng của bình đo tỷ khối.
m1 : khối lượng của bình đo tỷ khối và nước.
m2 : khối lượng của bình đo tỷ khối và tinh dầu.
Tiến hành:
Phương pháp xác định tỷ khối tinh dầu: Dụng cụ đo là bình đo tỷ khối (picnometer). Ban đầu cân bình đo tỷ khối rỗng (khối lượng m), rồi cân khi có nước
(m1) và khi có chất lỏng cần đo (m2). Tỷ lệ giữa khối lượng chất nghiên cứu và
nước là tỷ khối d.
2.2.3.5. Chỉ số khúc xạ của tinh dầu nghệ
Khái niệm : Chỉ số khúc xạ có độ lớn không đổi, bằng tỷ số của sin góc tới
α trên bề mặt phân chia hai môi trường và sin góc khúc xạ β [4].
N= sinα/ sinβ = C1/C2
Tương ứng với tỷ lệ của tốc độ ánh sáng trong môi trường 1( C1) với môi
Cách tiến hành
Đầu tiên bật máy đo chỉ số khúc xạ, đặt nhiệt độ ổn định là 200C. Chờ cho
đến khi nhiệt kế chỉ 200C thì bắt đầu đo. Trước hết nhỏ vài giọt nước cất vào lăng
kính, chỉnh máy đến khi thấy rõ ranh giới giữa 2 miền sáng tối. Làm sạch cuvet bằng axeton, lau khô. Nhỏ một giọt tinh dầu vào giữa cuvet, đóng cuvet. Điều chỉnh núm xoay sao cho đường phân cách tối sáng nằm chính giữa hai đường chéo thị
kính, đọc giá trị nD tương ứng [19].
2.2.4. Khảo sát thành phần hóa học của củ nghệ vàng Kon Tum trong một số dịch chiết dịch chiết
Dùng 50 gam nguyên liệu và 200ml dung môi, chiết với thứ tự dung môi
chiết là n-hexan, etylacetat, metanol, ở 800C. Thí nghiệm được mô tả ở hình 2.4.
Hình 2.4. Bộ dụng cụ chiết soxhlet
- Đo UV-VIS để xác định mật độ quang của dịch chiết.
- Phân tích và nhận dạng sơ bộ thành phần hóa học của dịch chiết củ nghệ vàng trong các dung môi bằng phương pháp sắc kí ghép nối khối phổ tại Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng II, số 2 Ngô Quyền, Đà Nẵng.
Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Thiết bị
GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry), các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…
Phương pháp sắc kí khí (GC)
Sắc kí khí là một trong những phương pháp quan trọng nhất hiện nay dùng để tách, định lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu các hợp chất hữu cơ.
Pha động trong GC là chất khí nên chất phân tích cũng phải được hoá hơi để
đưa vào cột sắc kí, thường hoá hơi dưới 2500C.
Pha tĩnh có thể là chất rắn được nhồi vào cột hay 1 màng film mỏng bám lên trên bề mặt chất mang trơ, hoặc có thể tạo thành một màng mỏng bám lên mặt trong của thành cột (cột mao quản).
Tuỳ thuộc vào bản chất pha tĩnh chia thành hai loại sắc ký khí :
- Sắc ký khí rắn (gas solid chromatography – GSC): Chất phân tích được hấp phụ trực tiếp trên pha tĩnh là các tiểu phân rắn.
- Sắc ký khí lỏng (gas liquid chromatography – GLC): Pha tĩnh là một chất lỏng không bay hơi.
Phương pháp này chỉ được giới hạn với chất có thể bốc hơi mà không bị phân huỷ hay là trong khi phân huỷ cho sản phẩm phân huỷ xác định dưới thể hơi.
Có 2 loại kĩ thuật phân tích:
- Giữ cho nhiệt độ không đổi trong suốt quá trình phân tích, phương pháp này khó tách hoàn toàn.