Cơ sở lý thuyết
Có thể tách tinh dầu bằng nhiều phương pháp như dùng dung môi hữu cơ để chưng ninh hoặc chiết Sohxlet, ép, trích ly, chưng cất lôi cuốn hơi nước, phương pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định. Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo thì khi chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn.
Phương pháp này có quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản, thiết bị gọn, dễ chế tạo, không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ, thời gian tương đối nhanh. Tuy nhiên không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp, chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bị phân hủy, không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu (đó là những chất định hương thiên nhiên rất có giá trị).
Tỉến hành
Chúng tôi thu tinh dầu nghệ bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, mỗi lần dùng khoảng 150g nguyên liệu tươi, đổ nước đến khoảng 2/3 bình cầu, dung tích bình cầu 1 lit, dùng bộ chiết tinh dầu nhẹ hơn nước. Lắp dụng cụ như hình
giờ), kết thúc quá trình chưng cất, thay bình cầu mới có chứa mẫu mới. Tinh dầu
được làm khan bằng Na2SO4, và giữ mát trong tủ lạnh trước khi xác định các chỉ số
hóa lý và thành phần hóa học.
Tinh dầu được phân tích và xác định thành phần bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ tại Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng II, số 2 Ngô Quyền. Đà Nẵng.
Hình 2.2. Dụng cụ chưng cất tinh dầu 2.2.3. Xác định các chỉ số hóa học
2.2.3.1.Chỉ số axit
Định nghĩa : Chỉ số axit được định nghĩa là số mg KOH cần dùng để trung
hòa các axit tự do có trong 1g tinh dầu. Cách tiến hành:
Cân 1g tinh dầu không lẫn nước, cho thêm 10ml etanol trung tính, nhỏ vài giọt phenolphtalein vào. Chuẩn độ bằng dung dịch KOH có nồng độ 0,913N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền vững.
Chỉ số axit được tính theo công thức: Ax = 56.C .VN
m Trong đó: V: Số ml KOH 0,0913 N đã dùng
m: Khối lượng tinh dầu đem trung hòa (g)
CN: Nồng độ dung dịch KOH
2.2.3.2 .Chỉ số este
Định nghĩa : Chỉ số este là số mg KOH xà phòng hoá hết lượng este có trong 1g tinh dầu.
Cách tiến hành:
Sử dụng mẫu đã xác định chỉ số axit ở trên, thêm chính xác 20ml dung dịch KOH 0,0913 N trong etanol. Lắp ống sinh hàn ngược vào bình và đun trong bếp cách thuỷ, đến khi phản ứng xà phòng kết thúc (khoảng 1 giờ, lúc đó dung dịch trong bình vẫn trong suốt và đồng đều, không biến đổi khi pha loãng với nước).Thí nghiệm được mô tả ở hình 2.3.
Cũng cùng một lúc song song với mẫu kiểm tra, làm một mẫu trống tương tự với 20 ml KOH 0,0913N trong etanol và 10ml etanol, tiến hành trong cùng điều kiện như trên, sau khi phản ứng xảy ra xong, cho vào cả hai mẫu mỗi bình 5 giọt chỉ thị màu phenolphtalein 0,2% và chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1N.
Hiệu số giữa số ml dung dịch HCl 0,01N đã dùng trong mẫu trắng và số ml đã dùng trong mẫu thử là số ml dung dịch KOH 0,01N đã dùng để xà phòng hoá các este có trong chất cần thử. Chỉ số este tính bằng công thức: S 56 ( 2 1).0,1 E m V V
Trong đó m: Số gam tinh dầu.
V1: Thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng chuẩn độ mẫu thí nghiệm (ml).
V2 : Thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng chuẩn độ mẫu trắng (ml).
2.2.3.3. Chỉ số xà phòng hóa
Chỉ số xà phòng hóa là số miligam KOH cần thiết để trung hòa các axit tự do và xà phòng hóa este chứa trong 1 gam tinh dầu.
Như vậy: Chỉ số xà phòng hoá bằng tổng chỉ số axit và chỉ số este.
2.2.3.4. Tỷ khối của tinh dầu nghệ
Định nghĩa: Tỷ khối của chất là tỷ lệ của khối lượng (m) đối với thể tích (V)
của chất: d = (g/cm3)
V m
Thông thường xác định tỷ khối tương đối d là tỷ khối của chất cần xác định so với tỷ khối của chất khác ở cùng điều kiện xác định:
d = m m m m 1 2 Trong đó d: tỉ khối
m : khối lượng của bình đo tỷ khối.
m1 : khối lượng của bình đo tỷ khối và nước.
m2 : khối lượng của bình đo tỷ khối và tinh dầu.
Tiến hành:
Phương pháp xác định tỷ khối tinh dầu: Dụng cụ đo là bình đo tỷ khối (picnometer). Ban đầu cân bình đo tỷ khối rỗng (khối lượng m), rồi cân khi có nước
(m1) và khi có chất lỏng cần đo (m2). Tỷ lệ giữa khối lượng chất nghiên cứu và
nước là tỷ khối d.
2.2.3.5. Chỉ số khúc xạ của tinh dầu nghệ
Khái niệm : Chỉ số khúc xạ có độ lớn không đổi, bằng tỷ số của sin góc tới
α trên bề mặt phân chia hai môi trường và sin góc khúc xạ β [4].
N= sinα/ sinβ = C1/C2
Tương ứng với tỷ lệ của tốc độ ánh sáng trong môi trường 1( C1) với môi
Cách tiến hành
Đầu tiên bật máy đo chỉ số khúc xạ, đặt nhiệt độ ổn định là 200C. Chờ cho
đến khi nhiệt kế chỉ 200C thì bắt đầu đo. Trước hết nhỏ vài giọt nước cất vào lăng
kính, chỉnh máy đến khi thấy rõ ranh giới giữa 2 miền sáng tối. Làm sạch cuvet bằng axeton, lau khô. Nhỏ một giọt tinh dầu vào giữa cuvet, đóng cuvet. Điều chỉnh núm xoay sao cho đường phân cách tối sáng nằm chính giữa hai đường chéo thị
kính, đọc giá trị nD tương ứng [19].
2.2.4. Khảo sát thành phần hóa học của củ nghệ vàng Kon Tum trong một số dịch chiết dịch chiết
Dùng 50 gam nguyên liệu và 200ml dung môi, chiết với thứ tự dung môi
chiết là n-hexan, etylacetat, metanol, ở 800C. Thí nghiệm được mô tả ở hình 2.4.
Hình 2.4. Bộ dụng cụ chiết soxhlet
- Đo UV-VIS để xác định mật độ quang của dịch chiết.
- Phân tích và nhận dạng sơ bộ thành phần hóa học của dịch chiết củ nghệ vàng trong các dung môi bằng phương pháp sắc kí ghép nối khối phổ tại Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng II, số 2 Ngô Quyền, Đà Nẵng.
Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Thiết bị
GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry), các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…
Phương pháp sắc kí khí (GC)
Sắc kí khí là một trong những phương pháp quan trọng nhất hiện nay dùng để tách, định lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu các hợp chất hữu cơ.
Pha động trong GC là chất khí nên chất phân tích cũng phải được hoá hơi để
đưa vào cột sắc kí, thường hoá hơi dưới 2500C.
Pha tĩnh có thể là chất rắn được nhồi vào cột hay 1 màng film mỏng bám lên trên bề mặt chất mang trơ, hoặc có thể tạo thành một màng mỏng bám lên mặt trong của thành cột (cột mao quản).
Tuỳ thuộc vào bản chất pha tĩnh chia thành hai loại sắc ký khí :
- Sắc ký khí rắn (gas solid chromatography – GSC): Chất phân tích được hấp phụ trực tiếp trên pha tĩnh là các tiểu phân rắn.
- Sắc ký khí lỏng (gas liquid chromatography – GLC): Pha tĩnh là một chất lỏng không bay hơi.
Phương pháp này chỉ được giới hạn với chất có thể bốc hơi mà không bị phân huỷ hay là trong khi phân huỷ cho sản phẩm phân huỷ xác định dưới thể hơi.
Có 2 loại kĩ thuật phân tích:
- Giữ cho nhiệt độ không đổi trong suốt quá trình phân tích, phương pháp này khó tách hoàn toàn.
- Thay đổi nhiệt độ trong quá trình phân tích, phương pháp này tuy tốn thời gian nhưng triệt để.
Nguyên tắc hoạt động
Nhờ có khí mang trong chứa trong bom khí (hoặc máy phát khí), mẫu từ
buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detectơ, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu được xử lí ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả ( bộ hiện số, máy in hoặc máy ghi). Trên sắc đồ nhận được, sẽ có tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là pic. Thời gian lưu của pic là đại lượng đặc trưng cho chất cần phân tích. Diện tích pic là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu.
Sắc đồ là tập hợp tất cả các pic, mỗi pic đại diện cho mỗi chất. Dựa vào thời gian lưu ta có thể xác định được tên chất và đo diện tích mỗi pic ta xác định được thành phần mỗi chất trong hỗn hợp.
Phương pháp khối phổ (MS)
Nguyên tắc của phương pháp khối phổ là dựa vào chất nghiên cứu được ion hoá trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân không bằng những phương pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử, ion mảnh…) có số khối khác nhau, sau đó những ion này được phân tách thành những dãy ion theo cùng số khối m (chính xác là theo cùng tỷ số khối trên điện tích ion, m/e) và xác suất có mặt của mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e được ghi lại trên đồ thị có trục tung là xác suất có mặt (hay cường độ), trục hoành là tỉ số m/e gọi là khối phổ đồ.
Phổ khối lượng được ghi lại dưới dạng phổ vạch hay bảng, trong đó cường độ các vạch được đo bằng phần trăm so với đỉnh có cường đọ cao nhất. Đỉnh ion phân tử thường là đỉnh cao nhất, tương đương với khối lượng phân tử của hợp chất khảo sát.
Phổ khối lượng không những cho phép xác định chính xác phân tử lượng, mà căn cứ vào các mảnh phân tử tạo thành, ta cũng suy ra được cấu trúc phân tử. Xác suất tạo thành mảnh phụ thuộc vào cường độ liên kết trong phân tử cũng như vào khả năng bền hoá các mảnh tạo thành nhờ các hiệu ứng khác nhau. Các mảnh có độ
bền lớn sẽ ưu tiên tạo thành, các liên kết yếu nhất dễ bị đứt nhất. Có những mảnh có khối lượng đặc trưng gọi là mảnh chìa khoá, chúng cho phép phân tích các phổ khối lượng dễ dàng.
2.2.5. Nghiên cứu các thông số công nghệ chiết tách trong dung môi có hàm lượng cấu tử cao nhất
Sau khi tiến hành chiết bằng các dung môi như trên, dịch chiết đem chạy GC/MS xác định thành phần hóa học, chọn dịch chiết có hàm lượng cao nhất để khảo sát các thông số công nghệ của quá trình chiết trong dung môi này bằng phương pháp chưng ninh.
2.2.5.1. Tỉ lệ rắn /lỏng
Cố định lượng nguyên liệu là 50g, thay đổi lượng dung môi , từ 160 ml,
180ml, 200ml, 220ml, 240ml, chưng ninh ở nhiệt độ 800C trong 5 giờ. Thu dịch
chiết, cô đuổi dung môi đến cùng 1 thể tích, mỗi mẫu lấy 1ml, sau đó pha loãng 50 lần rồi tiến hành đo UV-VIS.
2.2.5.2. Nhiệt độ
Cố định lượng nguyên liệu là 50g, tiến hành chưng ninh trong 200 ml dung môi bằng bình cầu 2 cổ 500ml ( cổ lớn lắp sinh hàn, cổ nhỏ lắp nhiệt kế) ở các
nhiệt độ 500C, 600C, 700C, 800C, 900C với thời gian chưng ninh là 7 giờ. Thu dịch
chiết sau đó pha loãng 50 lần rồi tiến hành đo UV-VIS.
2.2.5.3. Thời gian
Lấy 5 mẫu bột nghệ khô (50 gam/ 1 mẫu), Tiến hành chưng ninh trong 200
ml dung môi ở 800C với các khoảng thời gian khác nhau: 5giờ đến 11 giờ.
Thu dịch chiết sau đó pha loãng 50 lần rồi tiến hành đo UV-VIS.
2.3. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
Để thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài chúng tôi thực nghiệm theo sơ đồ quy trình thực nghiệm như sau.
Củ nghệ tươi (làm sạch, xắt lát)
Tách tinh dầu (chưng cất lôi cuốn hơi nước)
Tinh dầu GC - MS Bã Chiết bằng n- hexan Dịch chiết n-hecxan Bã Chiết bằng etylacetat Dịch chiết etylacetat Chiết bằng methanol Dịch chiết methanol Xác định đại lượng vật lí và hàm lượng kim loại nặng GC - MS Bã Bã Chọn dịch chiết có hàm lượng lớn nhất GC - MS GC - MS
Sơ đồ quy trình thực nghiệm 2
Dịch chiết có hàm lượng lớn nhất
Chiết tách chất trong dung môi đã lựa chọn
Xác định cấu trúc bằng các phương pháp phân tích công cụ
Nghiên cứu các thông số công nghệ
Nhiệt độ
Thời gian
Tỉ lệ Rắn/lỏng
Sơ đồ quy trình thực nghiệm 3: chiết tách chất rắn trong dung môi có hàm lượng lớn nhất
1. Rửa bằng cồn tuyệt đối. 2. Lọc Bột nghệ Dịch Chiết ở 800C Bỏ bã Cô ở 800 C Bỏ dung môi
Ete dầu hỏa Cắn 1
Dung môi có hàm lượng lớn nhất
Bỏ dung môi Cắn 2
Bỏ dịch lọc Cắn 3
Sơ đồ thực nghiệm 4
Cắn 3
Cắn 4 Dich lọc
Rửa bằng aceton và ete
Bột HPLC IR Sấy khô Làm nhiều lần UV-VIS Sắc kí bản mỏng
Rửa bằng cồn tuyệt đối
Cắn 5 Dich lọc bỏ
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ SỐ VẬT LÝ
Độ ẩm của nguyên liệu tươi, hàm lượng tro và hàm lượng các kim loại được xác định theo phương pháp ở phần 2.2.1, kết quả được trình bày ở bảng 3.1, 3.2, và 3.3. (Phụ lục 1)
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm trong củ nghệ tươi
STT m m1 m2 W (%) 1 5,028 34,528 30,404 82,020 2 5,040 37,74 33,660 80,950 3 5,003 30,763 26,691 81,391 4 4,994 37,502 33.469 80,757 5 5,017 36,267 32,193 81,204 Độ ẩm trung bình (%) 81,264
Trong đó: m : Khối lượng nguyên liệu (g).
m1: Khối lượng chén sứ và nguyên liệu (g).
m2: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g).
W (%): độ ẩm của mỗi mẫu.
1 2 W m m 100% (%) m Độ ẩm trung bình của củ nghệ là 81,264 % .
Độ ẩm của củ nghệ chính là hàm lượng nước có trong củ, như vậy trong thành phần củ có 81,264 % là nước. Các thành phần khác chiếm tỷ lệ còn lại. Độ ẩm càng lớn thì càng khó bảo quản, rất dễ bị thúi rữa, hư hỏng vì vậy sau khi thu hoạch cần có biện pháp xử lý và bảo quản nguyên liệu thích hợp như sấy khô, cất giữ nơi khô ráo.
Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm lượng tro
STT m(g) m0(g) m3(g) m4(g)
1 5.004 29.500 29.576 0.076
2 5.001 32.700 32.787 0.087
3 5.002 25.760 25.833 0.073
Hàm lượng tro trung bình (%) 0.078
Trong đó: m: Khối lượng nguyên liệu (g).
m0: Khối lượng chén (g)
m3: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hóa (g).
m4: Khối lượng tro (g) ( m4 = m3 – m0)
%H: Hàm lượng tro của mỗi mẫu.
Hàm lượng tro vô cơ còn la ̣i là 0.078 gam tương đương với 1.4%.
Kết quả xác định hàm lượng tro ở bảng 3.2 cho thấy hàm lượng tro trong nghệ vàng Kon Tum nhỏ, chứng tỏ hàm lượng các chất vô cơ, kim loại ít, giá trị sử