3.3.1. Chiết với dung môi n- hexan
Bã sau khi tách tinh dầu, được xử lý bằng cách sấy khô, xay mịn và chiết
soxhlet trong dung môi n-hexan, ở 800C. Dịch chiết củ nghệ vàng với dung môi n-
hexan thu được như trong hình 3.2. Thành phần và công thức cấu tạo các chất có trong dịch chiết n-hexan được xác định bằng phương pháp sắc kí ghép nối khối phổ (GC- MS) tại Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng II, số 2 Ngô Quyền, Thành Phố Đà Nẵng. (phụ lục 3).
Thành phần dịch chiết được trình bày ở bảng 3.121 ( Phụ lục 7) Sắc kí đồ GC xem ở hình 3.3. (Xem thêm ở phụ lục 13).
Bảng 3.11. Thành phần hóa học và công thức cấu tạo một số chất có hàm lượng cao trong dịch chiết với n-hexan.
STT Thời gian lưu (phút) Phần trăm (%)
Định danh Công thức cấu tạo
1 14.570 19.70 Tumerone
2 14.524 18.97 Ar-tumerone
Hình 3.2. Dịch chiết củ nghệ vàng trong dung môi n-hexan
O
3 14.933 15.94 Curlone O 4 12.831 2.09 Cyclohexene, 3-(1,5- dimethyl-4-hexenyl)-6- methylene-, [S-(R*,S*)]- 5 12.465 1.75 1,3-Cyclohexadiene, 5- (1,5-dimethyl-4-hexenyl)- 2-methylene-, [S- (R*,S*)]- 6 12.316 1.30 Benzen, 1-(1,5-dimethyl- 4-hexenyl)-4-methyl-
Dịch chiết n- hexan định danh được 17 cấu tử , số cấu tử chưa định danh được chiếm 36,23 %, các cấu tử có hàm lượng lớn trong dịch chiết n-hexan gồm: Tumerone, Curlone, Ar-tumerone, Cyclohexene, 3-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)- 6-methylene-, [S-(R*,S*)]-, 1,3-Cyclohexadiene, 5-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-2- methylene-, [S-(R*,S*)]-, Benzen, 1-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-4-methyl-
3.3.2. Chiết với dung môi etyl acetat
Bã sau khi chiết bằng dung môi n-hexan, đem sấy khô và chiết tiếp bằng dung môi etyl acetat, dịch chiết được xác định thành phần bằng phương pháp GC
Hình 3.3. Sắc ký đồ GC/MS của dịch chiết nghệ vàng trong n- hexan
/MS tại Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng II, số 2 Ngô Quyền, Thành Phố Đà Nẵng. (phụ lục 4).
Dịch chiết củ nghệ vàng với dung môi etyl acetat thu được như trong hình 3.4. Sắc kí đồ GC của dịch chiết trong dung môi etyl acetat thể hiện ở hình 3.5. (xem thêm ở phụ lục 14). Thành phần dịch chiết được trình bày ở bảng 3.12. (xem thêm ở phụ lục 8).
Hình 3.4. Dịch chiết củ nghệ vàng trong dung môi etyl acetat
Bảng 3.12. Thành phần hóa học và công thức cấu tạo một số chất có hàm lượng cao trong dịch chiết với etyl acetat
STT Thời gian
lưu (phút)
Phần trăm (%)
Định danh Công thức cấu tạo
1 14.929 30.72 Curlone O 2 14.538 23.73 Tumerone O 3 6.027 10.41 Limonene
4 12.863 9.80 Cyclohexene, 3-(1,5- dimethyl-4-hexenyl)-6-
methylene-, [S- (R*,S*)]-
Trong dung môi etylacetat định danh được 4 cấu tử, số cấu tử chưa được định danh chiếm 25,34%, các cấu tử có hàm lượng lớn trong dung môi etyl acetat gồm:
Cyclohexene,3-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-6-methylene-,[S-(R*,S*)]-, Tumerone, Curlone
Nhận xét:
Trong các cấu tử đã được định danh trong tinh dầu, có Ar-tumerol, tumerol, curlone có hàm lượng cao, đây là những chất có hoạt tính sinh học làm nên giá trị của tinh dầu. Như đã trình bày ở phần tổng quan, tinh dầu nghệ có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn và kìm hãm sự phát triển của các gốc tự do trong cơ thể, ngoài ra còn dung để chống côn trùng như muỗi khi pha loãng và bôi lên da.
Ar-tumerone: Curcumin và ar-tumerone là các chất chống oxy hóa. Khi
cùng tồn tại, chúng có thể làm tăng tác dụng của curcumin lên 10 lần. Curcumin và ar-tumerone giúp chống viêm, kể cả viêm khớp mãn tính, ung nhọt. Nó có thể giúp ngăn ngừa sự phát sinh và phát triển bệnh ung thư trong các giai đoạn đầu, giúp chống xơ hóa khi chiếu xạ.Ar-tumerol đã được nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn
có khả năng chống lại 4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, macerans Bacillus
licheniformis Bacillus và Azotobacter, trong đó tác dụng mạnh nhất là trên chủng
B. subtilis [25].
Eucalyptol (1,8-cineol): là chất lỏng không màu. Có nhiều trong dầu bạch
đàn. Eucalyptol có mùi long não, vị mát, có tính sát trùng, dùng rất tốt để chữa ho, kích thích tiêu hóa. Trong dược phẩm Eucalyptol có trong thành phần nước súc miệng và thuốc ho, nó điều khiển sự tăng tiết chất nhầy đường hô hấp và bệnh hen. Eucalyptol làm giảm viêm và giảm đau khi bôi ngoài da. Trong điều kiện thí nghiệm có thể tiêu diệt tế bào ung thư bạch cầu.
alpha-Phellandrene: Theo các tác giả “The Clinician's Handbook of Natural
Healing” thì alpha-Phellandrene có tính kháng khuẩn và kháng nấm, kháng viêm trong bệnh thấp khớp và đau dây thần kinh.
Limonene: là một monoterpene, là chất lỏng không màu. Có nhiều trong
chanh, cam, quýt. Limonene là một terpene tương đối bền với nhiệt nên có thể được chưng cất mà không phân hủy, tuy nhiên ở nhiệt độ cao có thể đứt mạch tạo isoprene. Dễ bị oxy không khí oxi hóa để tạo thành carveol, carvone, và oxit limonene, nó được sử dụng để tổng hợp carvone.
Limonene được sử dụng làm hương liệu trong sản xuất dược phẩm để làm mất mùi và vị đắng của thuốc. Trong y học D-limonene là thành phần thuốc làm giảm bệnh trào ngược dạ dày thực quản và chứng ợ nóng . Limonene được sử dụng như một dung môi làm sạch, ví dụ để loại bỏ dầu ở bộ phận trong máy móc. Vì dễ cháy, nên limonene đã được coi như là một nhiên liệu sinh học. Limonene có thể được sử dụng để hòa tan polystyrene, và có thể thay thế cho acetone [26].
3.3.3. Chiết với dung môi methanol
Dịch chiết củ nghệ vàng với dung môi methanol thu được như trong hình 3.6, dịch chiết được xác định thành phần bằng phương pháp sắc kí ghép nối khối (GC- MS) tại Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng II, số 2 Ngô Quyền, Thành Phố Đà Nẵng (xem thêm ở phụ lục 5), phổ GC/MS thể hiện ở hình 3.7 (phụ lục 15), thành phần dịch chiết được trình bày ở bảng 3.13. (xem thêm ở phụ lục 9).
Hình 3.6. Dịch chiết củ nghệ vàng bằng dung môi metanol
Trong dịch chiết với metanol có 7 được định danh, số cấu tử chưa được định
danh chiếm 29,15% trong đó 4 cấu tử có hàm lượng cao là: Ar-tumerone 17,64%, tumerone 29,81%, Curlone 17,19%, 2-Methoxy-4-vynylphenol: 3.06 %
Bảng 3.13 Thành phần hóa học và công thức cấu tạo một số chất có hàm lượng cao trong dịch chiết với metanol
STT
Thời gian lưu
Phần trăm
(%) Định danh Công thức cấu tạo
1 14.525 29.81 Tumerone O 2 14.476 17.64 Ar-tumerone O 3 14.899 17.19 Curlone O 4 10.150 3.06 2-Methoxy-4- vynylphenol
Hình 3.7. Sắc ký đồ GC của dịch chiết củ nghệ vàng trong dung môi metanol
Sau khi xác định được thành phần dịch chiết, so sánh với nghệ Quảng Trị cũng chiết bằng dung môi n-hexan ta thấy có sự khác biệt, thể hiện ở bảng so sánh 3.14. Trong ba cấu tử có hàm lượng cao thì có đến hai cấu tử trong nghệ Quảng Trị không có, chỉ có Ar-tumeron nhiều hơn nghệ Kon Tum nhưng không đáng kể.
Bảng 3.14. So sánh thành phần và hàm lượng trong dịch chiết n-hexan của nghệ vàng Kon Tum và Quảng Trị
ST T
Định danh Củ nghệ trên địa bàn tỉnh Kon Tum Củ nghệ vàng trên địa bàn tỉnh Quảng Trị 1 Tumerone 19.70 - 2 Ar-tumerone 18.97 22.64 3 Curlone 15.94 - 7 Cyclohexene, 3-(1,5-dimethyl-4- hexenyl)-6-methylene-, [S-(R*,S*)]- 2.09 17.29 4 1,3-Cyclohexadiene, 5-(1,5- dimethyl-4-hexenyl)-2-methylene-, [S-(R*,S*)]- 1.75 - 5 Benzen, 1-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)- 4-methyl- 1.30 5.64 6 Cyclohexene, 1-methyl-4-(5-methyl- 1methylene-4-hexenyl)-, (S)- 0.36 3.62 7 anpha-phellandrene 0.22 0.57 8 Caryophyllene 0.17 4.94
Nhận xét chung cho ba dịch chiết:
So sánh màu dịch chiết của n- hexan, etyl acetat, metanol ta thấy màu dịch chiết đậm dần từ vàng, nâu đỏ, đến vàng nâu đậm nguyên nhân có thể là vì: các dung môi trên có độ phân cực tăng dần từ n-hexan đến metanol, n- hexan là dung môi không phân cực, có thể trong đó có rất ít chất màu tan được nên màu nhạt nhất, còn trong etyl acetat độ phân cực lớn hơn, các chất màu tan trong đó nhiều hơn, tuy nhiên vẫn ít hơn so với trong metanol, metanol là một dung môi đa năng, có thể hòa tan cả chất không phân cực và phân cực như chất màu vì vậy màu của dịch chiết metanol đậm hơn màu của dịch chiết etylacetat.
Về số lượng cấu tử, trong dung môi metanol số cấu tử được xác định nhiều nhất, tiếp theo là n-hexanvà ít nhất là etyl acetat.
Cả 3 dịch chiết đều chứa Ar-tumerol, curlone, tumerol với hàm lượng cao. Đây đều là những chất có hoạt tính oxi hóa, kháng khuẩn cao, có giá trị sử dụng trong y học và dược phẩm.
Sau khi tiến hành chiết bằng các dung môi như trên, dịch chiết đem chạy
GC/MS xác định thành phần hóa học, kết quả là trong dung môi etyl acetat tuy rằng số lượng cấu tử ít hơn trong dịch chiết n-hexan và dịch chiết metanol nhưng hàm lượng các chất phát hiện được đều cao (xem bảng 3.15), tổng hàm lượng các cấu tử được định danh trong etyl acetat là lớn nhất 74,66%, metanol 70,85%, n-hexan 63,77%, ngoài ra kết hợp với kết quả khi đo UV-VIS để khảo sát dung môi chiết thích hợp nhất chúng tôi nhận thấy rằng mật độ quang của dung môi etyl acetat là cao nhất là 2.7372 (mật độ quang của metanol là 2.4150, n-hexan là 0.0471), có thể đây là dung môi dùng để chiết các chất màu trong củ nghệ hiệu quả nhất nên chúng tôi tiến hành khảo sát các thông số công nghệ của quá trình chiết trong dung môi này bằng phương pháp chưng ninh. Xem hình 3.8 phổ UV-VIS của các dịch chiết.
Bảng 3.15. So sánh hàm lượng một số chất trong 3 dịch chiết Dịch chiết n-hexan (%) Dịchchiết etyl acetat (%) Dịch chiết metanol (%) Ar-tumerone 18,97 - 17,64 Tumerone 19,70 23,73 29,81 Curlone 15,94 30,72 17,19 Limonene 0,03 10,41 -
Phổ UV-VIS của dịch chiết n-hexan (a)
Hình 3.8. Phổ UV-VIS của dịch chiết n-hexan (a), etyl acetat (b), metanol (c). 3.4. CÁC THÔNG SỐ CÔNG NGHỆ CỦA QUÁ TRÌNH CHIẾT TÁCH CHẤT RẮN TRONG DUNG MÔI ETYLACETAT
3.4.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng đến quá trình chiết
Tiến hành thí nghiệm như mục 2.2.5.1. Với thể tích dung môi thay đổi từ 180 ml đến 220 ml, khối lượng nguyên liệu bằng nhau. Sau khi chiết xong, cô đuổi dung môi đưa các dịch chiết về cùng một thể tích rồi lấy 1ml, pha loãng và đo UV-VIS.
Kết quả thu được trình bày ở bảng qua bảng 3.16 và biểu diễn bằng đồ thị ở hình 3.9.
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của tỉ lệ R-L đến quá trình chiết
STT Thể tích dung môi Mật độ quang
1 160 ml 2.1558
2 180ml 2.1901
3 200ml 2.2166
4 220ml 2.2168
5 240ml 2.2165
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ R-L đến mật độ quang Nhận xét: Từ bảng 3.16 và đồ thị hình 3.9, thấy rằng với cùng một khối lượng
nguyên liệu là 50g, ta tiến hành chưng ninh với thể tích dung môi etyl acetat tăng dần thì lượng các chất thu được càng nhiều. Đến tỉ lệ 50 gam nguyên liệu/220 ml dung môi thì lượng các chất thu được là lớn nhất nhưng không đáng kể so với khi dùng thể tích dung môi là 200 ml và khi tăng thể tích dung môi thành 240ml thì mật độ quang giảm, điều này có thể là do có chất nào đó đã bị phân hủy làm cho giá trị mật độ
quang giảm. Vì vậy chúng tôi chọn tỉ lệ rắn /lỏng tốt nhất là ¼, tức là 50 gam nguyên liệu / 200 ml dung môi.
3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết
Sau khi tiến hành chưng ninh, theo điều kiện nhiệt độ tăng dần từ 500C đến
90 0C, với khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi bằng nhau, thu các dịch
chiết. Lọc và pha loãng 50 lần rồi tiến hành đo UV-VIS.
Ta thu được kết quả như trong bảng 3.17 và thể hiện trên đồ thị hình 3.10.
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến mật độ quang
STT Nhiệt độ chiết (t0) Mật độ quang
1 50 2.2792
2 60 2.9064
3 70 3.2936
4 80 3.4697
5 90 3.4690
Từ kết quả ở bảng 3.17 và đồ thị hình 3.10 thấy rằng khi tăng nhiệt độ thì
mật độ quang tăng , đến 800C thì mật độ quang cao nhất, khi tiếp tục tăng nhiệt độ
thì mật độ quang giảm.
Vậy nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết bằng dung môi etylacetat là 800C.
3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết
Tiến hành chưng ninh với các thời gian chiết tăng dần từ 2 đến 11h, khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi bằng nhau, ở nhiệt độ thích hợp nhất vừa khảo sát, thu dịch chiết, lọc, đo mật độ quang. Kết quả được trình bày ở bảng 3.18 và biểu diễn trên đồ thị 3.11.
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến mật độ quang
STT Thời gian chiết (giờ) Mật độ quang
1 4h 2.1972 2 5h 2.2126 3 6h 2.3241 4 7h 2.5534 5 8h 2.8854 6 9h 3.1253 7 10h 3.1223 8 11h 3.1223
Từ bảng 3.16 và đồ thị hình 3.12 , ta thấy khi tăng thời gian chiết tách thì mật độ quang tăng, đạt giá trị cao nhất ở 9h, sau 10 giờ thì mật độ quang hầu như không
thay đổi vì ở nhiệt độ 800C có thể các chất chưa bị nhiệt phân hủy. Vậy, thời gian
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết đến mật độ quang 3.5. KIỂM TRA SẢN PHẨM TINH CHẾ ĐƯỢC
3.5.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại IR của chất rắn được kiểm tra ở Phòng Kiểm tra chất lượng sản phẩm công ty Dược Danapha. (Xem thêm ở phụ lục 10). Xem hình 3.12.
Dựa vào hướng dẫn giải phổ đồ chúng tôi xác định được các liên kết và nhóm chức đặc trưng của cấu tử trong chất rắn [16].
Qua tìm hiểu, nghiên cứu tài liệu, chúng tôi nhận thấy phổ hồng ngoại của chất rắn thu được rất giống với phổ hồng ngoại của hợp chất curcumin tinh khiết và so sánh với λcurcumin tinh khiết thấy có sự tương đồng của các đỉnh dao động. Xem bảng 3.19.
Hình 3.1 2 . Phổ hồng ngoại IR của ch ất rắn tinh chế được
Bảng 3.19. So sánh λ của các liên kết, nhóm chức của chất rắn với tài liệu khác. Liên kết và nhóm chức Chuẩn Curcumin Chất rắn -OH 3600 - 3200 3511,27 3500 -C=O 1750 – 1650 1627.10 1620 -C=C- 1650 – 1600 1602.87 1625 C- O -C- 1150 – 1100 1153.97 1150 3050 3015,62 2930 1600 - 1500 1509,23 1515 1470 1429.61 1400 900-700 856.35 750 3.5.2. Tính chất vật lý
- Chất rắn dạng kết tinh, màu vàng, không tan trong nước, ete dầu hoả, tan tốt trong etyl axetat.
- Nhiệt độ nóng chảy 180 - 1820C.
Các quan sát cảm quan và đối chiếu với nhiệt độ nóng chảy của curcumin
tinh khiết thấy phù hợp.
3.5.3. Phổ UV –VIS
Phổ UV –VIS được kiểm tra ở được kiểm tra ở Phòng Kiểm tra chất lượng sản phẩm công ty Dược Danapha. Xem hình 3.13. . (Xem thêm ở phụ lục 11).
chuẩn đều bằng 426nm. Điều này xác nhận sự có mặt của curcumin trong mẫu.
Hình 3.13. Phổ UV-VIS của curcumin I
Như vậy qua 2 phổ IR và UV-VIS của chất rắn màu vàng cam chúng tôi khẳng định khả năng lớn chất rắn thu được là curcumin. Để đầy đủ dữ kiện kết luận chính xác hơn thì chúng ta cần tiếp tục nghiên cứu thêm.
3.5.4. Phương pháp sắc kí bản mỏng
Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi chlorofom/acid acetic (tỉ lệ 9:1). Trên bản mỏng xuất hiện 3 vệt màu vàng, đối chiếu với vết của curcumin chuẩn thấy tương ứng. Đây chính là vết của Curcumin I, II, III. Được thể hiện trong hình 3.14.
Hình 3.14. Sắc kí bản mỏng chất rắn thu được 3.5.5. Định tính
Cân khoảng 0,1 g chất rắn cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan trong cồn
960, lắc đều đến khi mẫu tan hoàn toàn, thu được dung dịch màu vàng. Định tính