Dịch chiết củ nghệ vàng với dung môi methanol thu được như trong hình 3.6, dịch chiết được xác định thành phần bằng phương pháp sắc kí ghép nối khối (GC- MS) tại Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng II, số 2 Ngô Quyền, Thành Phố Đà Nẵng (xem thêm ở phụ lục 5), phổ GC/MS thể hiện ở hình 3.7 (phụ lục 15), thành phần dịch chiết được trình bày ở bảng 3.13. (xem thêm ở phụ lục 9).
Hình 3.6. Dịch chiết củ nghệ vàng bằng dung môi metanol
Trong dịch chiết với metanol có 7 được định danh, số cấu tử chưa được định
danh chiếm 29,15% trong đó 4 cấu tử có hàm lượng cao là: Ar-tumerone 17,64%, tumerone 29,81%, Curlone 17,19%, 2-Methoxy-4-vynylphenol: 3.06 %
Bảng 3.13 Thành phần hóa học và công thức cấu tạo một số chất có hàm lượng cao trong dịch chiết với metanol
STT
Thời gian lưu
Phần trăm
(%) Định danh Công thức cấu tạo
1 14.525 29.81 Tumerone O 2 14.476 17.64 Ar-tumerone O 3 14.899 17.19 Curlone O 4 10.150 3.06 2-Methoxy-4- vynylphenol
Hình 3.7. Sắc ký đồ GC của dịch chiết củ nghệ vàng trong dung môi metanol
Sau khi xác định được thành phần dịch chiết, so sánh với nghệ Quảng Trị cũng chiết bằng dung môi n-hexan ta thấy có sự khác biệt, thể hiện ở bảng so sánh 3.14. Trong ba cấu tử có hàm lượng cao thì có đến hai cấu tử trong nghệ Quảng Trị không có, chỉ có Ar-tumeron nhiều hơn nghệ Kon Tum nhưng không đáng kể.
Bảng 3.14. So sánh thành phần và hàm lượng trong dịch chiết n-hexan của nghệ vàng Kon Tum và Quảng Trị
ST T
Định danh Củ nghệ trên địa bàn tỉnh Kon Tum Củ nghệ vàng trên địa bàn tỉnh Quảng Trị 1 Tumerone 19.70 - 2 Ar-tumerone 18.97 22.64 3 Curlone 15.94 - 7 Cyclohexene, 3-(1,5-dimethyl-4- hexenyl)-6-methylene-, [S-(R*,S*)]- 2.09 17.29 4 1,3-Cyclohexadiene, 5-(1,5- dimethyl-4-hexenyl)-2-methylene-, [S-(R*,S*)]- 1.75 - 5 Benzen, 1-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)- 4-methyl- 1.30 5.64 6 Cyclohexene, 1-methyl-4-(5-methyl- 1methylene-4-hexenyl)-, (S)- 0.36 3.62 7 anpha-phellandrene 0.22 0.57 8 Caryophyllene 0.17 4.94
Nhận xét chung cho ba dịch chiết:
So sánh màu dịch chiết của n- hexan, etyl acetat, metanol ta thấy màu dịch chiết đậm dần từ vàng, nâu đỏ, đến vàng nâu đậm nguyên nhân có thể là vì: các dung môi trên có độ phân cực tăng dần từ n-hexan đến metanol, n- hexan là dung môi không phân cực, có thể trong đó có rất ít chất màu tan được nên màu nhạt nhất, còn trong etyl acetat độ phân cực lớn hơn, các chất màu tan trong đó nhiều hơn, tuy nhiên vẫn ít hơn so với trong metanol, metanol là một dung môi đa năng, có thể hòa tan cả chất không phân cực và phân cực như chất màu vì vậy màu của dịch chiết metanol đậm hơn màu của dịch chiết etylacetat.
Về số lượng cấu tử, trong dung môi metanol số cấu tử được xác định nhiều nhất, tiếp theo là n-hexanvà ít nhất là etyl acetat.
Cả 3 dịch chiết đều chứa Ar-tumerol, curlone, tumerol với hàm lượng cao. Đây đều là những chất có hoạt tính oxi hóa, kháng khuẩn cao, có giá trị sử dụng trong y học và dược phẩm.
Sau khi tiến hành chiết bằng các dung môi như trên, dịch chiết đem chạy
GC/MS xác định thành phần hóa học, kết quả là trong dung môi etyl acetat tuy rằng số lượng cấu tử ít hơn trong dịch chiết n-hexan và dịch chiết metanol nhưng hàm lượng các chất phát hiện được đều cao (xem bảng 3.15), tổng hàm lượng các cấu tử được định danh trong etyl acetat là lớn nhất 74,66%, metanol 70,85%, n-hexan 63,77%, ngoài ra kết hợp với kết quả khi đo UV-VIS để khảo sát dung môi chiết thích hợp nhất chúng tôi nhận thấy rằng mật độ quang của dung môi etyl acetat là cao nhất là 2.7372 (mật độ quang của metanol là 2.4150, n-hexan là 0.0471), có thể đây là dung môi dùng để chiết các chất màu trong củ nghệ hiệu quả nhất nên chúng tôi tiến hành khảo sát các thông số công nghệ của quá trình chiết trong dung môi này bằng phương pháp chưng ninh. Xem hình 3.8 phổ UV-VIS của các dịch chiết.
Bảng 3.15. So sánh hàm lượng một số chất trong 3 dịch chiết Dịch chiết n-hexan (%) Dịchchiết etyl acetat (%) Dịch chiết metanol (%) Ar-tumerone 18,97 - 17,64 Tumerone 19,70 23,73 29,81 Curlone 15,94 30,72 17,19 Limonene 0,03 10,41 -
Phổ UV-VIS của dịch chiết n-hexan (a)
Hình 3.8. Phổ UV-VIS của dịch chiết n-hexan (a), etyl acetat (b), metanol (c). 3.4. CÁC THÔNG SỐ CÔNG NGHỆ CỦA QUÁ TRÌNH CHIẾT TÁCH CHẤT RẮN TRONG DUNG MÔI ETYLACETAT
3.4.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng đến quá trình chiết
Tiến hành thí nghiệm như mục 2.2.5.1. Với thể tích dung môi thay đổi từ 180 ml đến 220 ml, khối lượng nguyên liệu bằng nhau. Sau khi chiết xong, cô đuổi dung môi đưa các dịch chiết về cùng một thể tích rồi lấy 1ml, pha loãng và đo UV-VIS.
Kết quả thu được trình bày ở bảng qua bảng 3.16 và biểu diễn bằng đồ thị ở hình 3.9.
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của tỉ lệ R-L đến quá trình chiết
STT Thể tích dung môi Mật độ quang
1 160 ml 2.1558
2 180ml 2.1901
3 200ml 2.2166
4 220ml 2.2168
5 240ml 2.2165
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ R-L đến mật độ quang Nhận xét: Từ bảng 3.16 và đồ thị hình 3.9, thấy rằng với cùng một khối lượng
nguyên liệu là 50g, ta tiến hành chưng ninh với thể tích dung môi etyl acetat tăng dần thì lượng các chất thu được càng nhiều. Đến tỉ lệ 50 gam nguyên liệu/220 ml dung môi thì lượng các chất thu được là lớn nhất nhưng không đáng kể so với khi dùng thể tích dung môi là 200 ml và khi tăng thể tích dung môi thành 240ml thì mật độ quang giảm, điều này có thể là do có chất nào đó đã bị phân hủy làm cho giá trị mật độ
quang giảm. Vì vậy chúng tôi chọn tỉ lệ rắn /lỏng tốt nhất là ¼, tức là 50 gam nguyên liệu / 200 ml dung môi.
3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết
Sau khi tiến hành chưng ninh, theo điều kiện nhiệt độ tăng dần từ 500C đến
90 0C, với khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi bằng nhau, thu các dịch
chiết. Lọc và pha loãng 50 lần rồi tiến hành đo UV-VIS.
Ta thu được kết quả như trong bảng 3.17 và thể hiện trên đồ thị hình 3.10.
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến mật độ quang
STT Nhiệt độ chiết (t0) Mật độ quang
1 50 2.2792
2 60 2.9064
3 70 3.2936
4 80 3.4697
5 90 3.4690
Từ kết quả ở bảng 3.17 và đồ thị hình 3.10 thấy rằng khi tăng nhiệt độ thì
mật độ quang tăng , đến 800C thì mật độ quang cao nhất, khi tiếp tục tăng nhiệt độ
thì mật độ quang giảm.
Vậy nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết bằng dung môi etylacetat là 800C.
3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết
Tiến hành chưng ninh với các thời gian chiết tăng dần từ 2 đến 11h, khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi bằng nhau, ở nhiệt độ thích hợp nhất vừa khảo sát, thu dịch chiết, lọc, đo mật độ quang. Kết quả được trình bày ở bảng 3.18 và biểu diễn trên đồ thị 3.11.
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến mật độ quang
STT Thời gian chiết (giờ) Mật độ quang
1 4h 2.1972 2 5h 2.2126 3 6h 2.3241 4 7h 2.5534 5 8h 2.8854 6 9h 3.1253 7 10h 3.1223 8 11h 3.1223
Từ bảng 3.16 và đồ thị hình 3.12 , ta thấy khi tăng thời gian chiết tách thì mật độ quang tăng, đạt giá trị cao nhất ở 9h, sau 10 giờ thì mật độ quang hầu như không
thay đổi vì ở nhiệt độ 800C có thể các chất chưa bị nhiệt phân hủy. Vậy, thời gian
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết đến mật độ quang 3.5. KIỂM TRA SẢN PHẨM TINH CHẾ ĐƯỢC
3.5.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại IR của chất rắn được kiểm tra ở Phòng Kiểm tra chất lượng sản phẩm công ty Dược Danapha. (Xem thêm ở phụ lục 10). Xem hình 3.12.
Dựa vào hướng dẫn giải phổ đồ chúng tôi xác định được các liên kết và nhóm chức đặc trưng của cấu tử trong chất rắn [16].
Qua tìm hiểu, nghiên cứu tài liệu, chúng tôi nhận thấy phổ hồng ngoại của chất rắn thu được rất giống với phổ hồng ngoại của hợp chất curcumin tinh khiết và so sánh với λcurcumin tinh khiết thấy có sự tương đồng của các đỉnh dao động. Xem bảng 3.19.
Hình 3.1 2 . Phổ hồng ngoại IR của ch ất rắn tinh chế được
Bảng 3.19. So sánh λ của các liên kết, nhóm chức của chất rắn với tài liệu khác. Liên kết và nhóm chức Chuẩn Curcumin Chất rắn -OH 3600 - 3200 3511,27 3500 -C=O 1750 – 1650 1627.10 1620 -C=C- 1650 – 1600 1602.87 1625 C- O -C- 1150 – 1100 1153.97 1150 3050 3015,62 2930 1600 - 1500 1509,23 1515 1470 1429.61 1400 900-700 856.35 750 3.5.2. Tính chất vật lý
- Chất rắn dạng kết tinh, màu vàng, không tan trong nước, ete dầu hoả, tan tốt trong etyl axetat.
- Nhiệt độ nóng chảy 180 - 1820C.
Các quan sát cảm quan và đối chiếu với nhiệt độ nóng chảy của curcumin
tinh khiết thấy phù hợp.
3.5.3. Phổ UV –VIS
Phổ UV –VIS được kiểm tra ở được kiểm tra ở Phòng Kiểm tra chất lượng sản phẩm công ty Dược Danapha. Xem hình 3.13. . (Xem thêm ở phụ lục 11).
chuẩn đều bằng 426nm. Điều này xác nhận sự có mặt của curcumin trong mẫu.
Hình 3.13. Phổ UV-VIS của curcumin I
Như vậy qua 2 phổ IR và UV-VIS của chất rắn màu vàng cam chúng tôi khẳng định khả năng lớn chất rắn thu được là curcumin. Để đầy đủ dữ kiện kết luận chính xác hơn thì chúng ta cần tiếp tục nghiên cứu thêm.
3.5.4. Phương pháp sắc kí bản mỏng
Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi chlorofom/acid acetic (tỉ lệ 9:1). Trên bản mỏng xuất hiện 3 vệt màu vàng, đối chiếu với vết của curcumin chuẩn thấy tương ứng. Đây chính là vết của Curcumin I, II, III. Được thể hiện trong hình 3.14.
Hình 3.14. Sắc kí bản mỏng chất rắn thu được 3.5.5. Định tính
Cân khoảng 0,1 g chất rắn cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan trong cồn
960, lắc đều đến khi mẫu tan hoàn toàn, thu được dung dịch màu vàng. Định tính
bằng phản ứng màu với các dung dịch H2SO4, KOH, NaOH. Thu được các màu như
ở hình 3.15.
* Lấy 0,5ml dung dịch, thêm 1 giọt dung dịch axit H2SO4 10%, dung dịch
chuyển sang màu đỏ tím, như trong ống nghiệm1.
* Lấy 0,5ml dung dịch, thêm 1 giọt dung dịch KOH 30%, dung dịch chuyển sang màu đỏ sẫm, như trong ống nghiệm 3.
* Lấy 0,5ml dung dịch, thêm 1 giọt dung dịch NaOH 30%, dung dịch chuyển sang màu đỏ máu, như trong ống nghiệm 2.
Hình 3.15. Kết quả các ống nghiệm định tính chất rắn thu được
Bằng các phản ứng màu đặc trưng như trên thấy chất màu thu được cho
những phản ứng màu giống với curcumin.
3.5.6. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp
Từ 2 phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn ta xác định được thời gian lưu của mẫu chuẩn là 10,87 phút, thời gian lưu của mẫu chất rắn thử là 10,92 phút, xấp xỉ nhau. Và kết quả bán định lượng curcumin 1 là 74,114%. Xem hình 3.16, 3.17.
Hình 3.1 7 . S ắc kí đ ồ c ủ a curcu min ch u ẩn v à curcumi n th ử
3.5.7. Hoạt tính sinh học
Curcumin sau khi kết tinh được gửi mẫu thử hoạt tính độc tế bào tại phòng thử hoạt tính sinh học – Viện hóa học.
Kết quả: Curcumin thu được từ củ nghệ vàng trên địa bàn tỉnh Kon Tum có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng MCF7 với giá trị IC 50 (nửa liều chết tối đa) là 64µg/ml. (Xem ở phụ lục 16 ).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ *. KẾT LUẬN
Qua các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học cây nghệ vàng (Curcuma longa .Linneaus) ở tỉnh Kon Tum chúng tôi thu được một số kết quả sau:
1. Tinh dầu:
Đã thu được tinh dầu củ nghệ vàng bằng phương pháp chưng cất hơi nước. Tinh dầu củ nghệ vàng có các thông số vật lý, hóa học:
Chỉ số axit: 1,115 Chỉ số este: 4,694 Chỉ số xà phòng: 5,809 Chỉ số khúc xạ: 1,51 Tỉ khối: 0,9724
Đã định danh được thành phần của tinh dầu nghệ vàng gồm 20 cấu tử trong đó có 10 cấu tử với hàm lượng lớn.
2. Dịch chiết
Đã chiết tách được các hợp chất hóa học có trong củ nghệ vàng bằng dung môi n-hexan, etyl acetat và metanol.
Dịch chiết được định danh bằng phương pháp sắc kí ghép nối khối phổ (GC/MS).
Trong dịch chiết n-hexan của nguyên liệu: đã định danh được 17 cấu tử, trong đó có 6 cấu tử có hàm lượng lớn.
Trong dịch chiết etyl acetat của bã sau khi chiết với n-hexan: đã định danh được 4 cấu tử, đều có hàm lượng lớn.
Trong dịch chiết metanol của bã sau khi chiết với etyl acetat: đã định danh được 7 cấu tử.
Từ đó chọn dịch chiết có hàm lượng cấu tử lớn nhất tiếp tục khảo sát các điều kiện thích hợp nhất để chiết tách.
học từ củ nghệ vàng bằng etyl acetat:
Nhiệt độ: 800C, thời gian: 9h, tỉ lệ rắn/lỏng:1/4 (50gam /200 ml)
3. Đã chiết tách được hợp chất curcumin từ dịch chiết etyl acetat, kiểm tra
các chỉ tiêu cảm quan và bằng các phương pháp IR, UV-VIS, HPLC. Xác định được hàm lượng curcumin I chiếm 74,114% trong mẫu thử.
4. Curcumin tinh khiết chiết tách từ củ nghệ vàng Kon Tum được xác định
hoạt tính kháng khuẩn tại viện hóa học, kết quả curcumin có hoạt tính gây độc tế bào trên dòng MCF7 với giá trị IC 50 (nửa liều chết tối đa) là 64µg/ml.
*. KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tu ̣c nghiên cứu chiết tách curcumin từ các loa ̣i nghệ vàng ở các vùng
sinh thái khác nhau và so sánh để xác định vùng sinh thái cho hàm lượng curcumin
lớ n nhất, trên cơ sở đó đưa ra quy hoạch vùng trồng nghệ.
2. Nghiên cứ u khảo sát các điều kiê ̣n chiết tách curcumin từ củ nghệ vàng
trên quy mô lớ n hơn.
3. Nghiên cứ u sản xuất thực phẩm chức năng từ củ nghệ vàng để nâng cao
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
[1] Võ Văn Chi (1998), Cây rau làm thuốc, NXB tổng hợp Đồng Tháp.
[2] Võ Văn Chi (1998), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB y học Tp Hồ Chí
Minh.
[3] Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Nxb khoa học và kỹ thuật.
[4] Trịnh Đình Chính, Nguyễn Thị Bích Tuyết (2003), Giáo trình hợp chất tự
nhiên, Huế.
[5] Đào Hùng Cường (2011), Hương liệu và tinh dầu, Đà Nẵng.
[6] Nguyễn Xuân Dũng, Phạm Thanh Kỳ, Phạm Xuân Trường, Bùi Thọ Uẩn
(1996), “Kết quả nghiên cứu tinh dầu rễ, thân rễ, và lá loài Curcuma
cochinchinensis, họ Gừng (Zingiberaceae)”, Dược học, số 5, tr.9-11.
[7] Văn Ngọc Hướng, Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn (1997), “Hoạt chất sinh
học từ một số loài Curcuma (Zingiberaceae) của Việt Nam. Đóng góp vào việc nghiên cứu các hoạt chất có hoạt tính chống vi khuẩn từ thân rễ nghệ xanh”, Tạp chí hóa học, T.35, số 2, tr.52-56.
[8] Đỗ Tất Lợi (1993), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, in lần thứ 5, NXB
Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội,
[9] Văn Quyền Mai (2000), Những cây rau gia vị phổ biến ở Việt Nam, Nhà xuất
bản Nông nghiệp.
[10] Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, in lần thứ 5, NXB Khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội, tr.562-567.
[11] Lê Quang Toàn (1999), “Tổng quan về thành tựu trong nghiên cứu hợp chất thiên nhiên từ thực vật dùng để phòng và chữa bệnh”, Tạp chí hóa học, T.54, số 5, Hà Nội
[12] Nguyễn Thị Bích Tuyết (2001), Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu một
số cây thuộc chi Curcuma và chi Kaempferia (họ Zingiberaceae) ở Việt Nam,
[13] Trung tâm thông tin khoa học công an, Viện chiến lược và khoa học công an (2004), Thuốc hay quanh ta, Hà Nội.