6. Bố cục của luận văn
1.3.5. Tính diệt khuẩn của nano berberin
Cơ chế diệt khuẩn của berberin
Hiện nay, do vi khuẩn ngày càng kháng thuốc kháng sinh nên các nhà khoa học đang tập trung đi tìm các tác nhân mới để diệt chúng và kháng sinh có nguồn gốc thực vật là một trong những chất được tập trung nghiên cứu mạnh nhất.
Những năm gần đây, một số nghiên cứu ở nước ngoài đã xác định berberin có tác dụng chống lại nhiều loại vi khuẩn gram dương (nhuộm theo phương pháp gram, nó bắt màu tím), gram âm (có màu đỏ), và các vi khuẩn kháng acid.
Tuy nhiên cho tới nay, cơ chế kháng vi sinh vật của berberin vẫn chưa được hiểu biết rõ ràng.
Liều tiêu chuẩn của berberin đối với người trưởng thành là 900-2000mg một ngày, chia làm 3-4 lần. Berberine được dùng trước bữa ăn, hoặc không lâu sau đó, để tận dụng lợi thế của đường huyết và lipid kết hợp với ăn uống [20].
Kích thước, hình dạng hạt, nồng độ và sự phân bố là các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến tính kháng khuẩn của hệ nano berberin. Cụ thể:
+ Kích thước hạt nano berberin là yếu tố quan trọng quyết định khả năng diệt
càng mạnh, vì khi ở kích thước càng nhỏ thì tỉ số giữa diện tích bề mặt và thể tích càng lớn và hạt cũng có thể dễ dàng tương tác với vi khuẩn hơn. Tuy nhiên các hạt có kích thước nhỏ lại có khuynh hướng liên kết với nhau trong quá trình lưu trữ tạo thành các hạt lớn hơn gây ảnh hưởng tới khả năng diệt khuẩn và bảo quản. Do đó, chúng ta tạo phải chú ý tránh hiện tượng keo tụ trong quá trình bào chế.
+ Hỗn dịch nano berberin có nồng độ càng cao và sự phân bố đều thì khả năng diệt khuẩn càng tốt. Tuy nhiên, khi nồng độ hạt nano quá cao, năng lượng bề mặt hạt nano lớn, nên các hạt nano berberin sẽ va chạm vào nhau và phá vỡ cấu trúc nano. Vì vậy, chúng ta cũng cần tìm nồng độ thích hợp để các hạt phân bố đồng đều, và tránh hiện tượng sa lắng.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất TT Tên nguyên liệu, TT Tên nguyên liệu,
hóa chất
Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Acetonitril Đức Tinh khiết phân tích
2 Acid hydroclorid Trung Quốc Tinh khiết hóa học
3 Aerosil Trung Quốc Tinh khiết hóa học
4 Berberin clorid chuẩn Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương Dược điển VN IV
5 Berberin clorid
nguyên liệu (50%) Việt Nam Cơ sở
6 Ethanol 96% Việt Nam DĐVN IV
7 HPMC Trung Quốc Tinh khiết hóa học
8 Manitol Trung Quốc Tinh khiết hóa học
9 NaCl Việt Nam Cơ sở
10 Natri deoxycholat Trung Quốc Tinh khiết hóa học
11 Nước cất Việt Nam DĐ VN IV
12 Poloxamer F127 Trung Quốc Tinh khiết hóa học
13 Polyvinylpirolidon K30 Trung Quốc Tinh khiết hóa học
14 Than hoạt tính Trung Quốc Tinh khiết hóa học
15 Tween 80 Trung Quốc Tinh khiết hóa học
2.1.2. Thiết bị
- Bình chiết, bông, phễu lọc Buchner, bộ chiết Schoxlet.
- Kính hiển vi điện tử FESEM Hitachi S – 4810 (Nhật Bản)
- Màng lọc cellulose acetat, Sartorius (Đức) 0,45 μm.
- Máy khuấy từ có giá nhiệt Thermo (Đức)
- Máy lắc ngang HY -2 (Trung Quốc)
- Máy li tâm sigma Sartorius (Đức)
- Máy nghiền bi Retsch MM20 (Đức)
- Máy phun sấy Spray Dryer SD 05
- Máy đồng hóa mẫu IKA T25 DIGITAL (Đức)
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimaduzu (Nhật Bản)
- Máy siêu âm Transonic (Đức)
- Máy xay, máy li tâm, máy hút chân không, bếp đun cách thủy
- Tủ sấy, cân kỹ thuật, cân phân tích và dụng cụ thủy tinh.
- Thiết bị thử độ hòa tan Erweka –DT (Đức)
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.2.1. Phương pháp kiểm tra chất lượng nguyên liệu Berberin clorid và sản phẩm tinh chế theo Dược điển Việt Nam IV phẩm tinh chế theo Dược điển Việt Nam IV
a. Định lượng
Theo phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao [5].
b. Tiến hành
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 10mg berberin clorid chuẩn ( mc), hòa tan vào bình định mức 100ml trong pha động thu được dung dịch có nồng độ khoảng 0,1mg/ml (Cc).
- Dung dịch thử
Mẫu thử là berberin clorid thô hoặc berberin clorid tinh chế. Cân chính xác lượng mẫu (mt) tương đương với 10 mg berberin clorid vào bình định mức 100ml. Thêm 100ml pha động, đánh siêu âm, lắc cho đến khi tan hết, bổ sung pha động đến vạch thu được dung dịch có nồng độ C1. Lọc qua màng lọc 0,45 μm, bỏ 20ml lọc đầu thu được dung dịch thử.
- Pha động: Hòa tan 1,7 gam natri laurylsulfat và 3,4 gam Kali dihydrophosphat trong hỗn hợp nước acetonitril (1:1) và pha loãng thành 1000ml với cùng dung môi.
Cột thép không gỉ được nhồi pha tĩnh. Pha tĩnh: Silicagen C18 ( 5 micromet)
Detector quang phổ tử ngoại khả kiến đặt ở bước sóng 345 nm Nhiệt độ cột: 40 0C
Tốc độ dòng: 1ml/phút Thể tích tiêm: 5 μm.
Cách tiến hành: lần lượt tiêm 5 microlit dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc kí, tiến hành sắc kí theo điều kiện đã mô tả.
c. Tính toán kết quả
Lượng berberin clorid trong mẫu thử là:
% 100 * * * * * * % Hc mt dflt Sc mc dflc St X Trong đó:
- St: diện tích trung bình của mẫu thử. - Sc: là diện tích trung bình của mẫu chuẩn. - dflt: độ pha loãng chất thử
- dflc: độ pha loãng chất chuẩn
- mt: khối lượng cân chất thử (gam)
- mc: khối lượng cân chất chuẩn (gam)
- Hc: hàm lượng chất chuẩn (%) được ghi trên nhãn ống chuẩn
Hiệu suất của quá trình tinh chế:
Hiệu suất tinh chế= (khối lượng sản phẩm x hàm lượng sản phẩm/ khối lượng ban đầu /hàm lượng ban đầu) x 100%
% 100 * * * % 1 1 2 2 H m H m H Trong đó:
- m2: khối lượng của sản phẩm sau tinh chế. - m1: khối lượng berberin nguyên liệu ban đầu. - H2: hàm lượng Berberin sau tinh chế
- H1: hàm lượng Berberin ban đầu.
d. Xử lí số liệu
Dữ liệu thu được được xử lí bằng phương pháp thống kê – sử dụng công cụ hỗ trợ là phầnmềm Microsoft excel. - Giá trị trung bình: n i i X n x 1 1 - Độ lệch chuẩn: 1 ) ( 1 2 n x X S n i
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): % *100
x S RSD - Sai số chuẩn: n S Sx
- Sai số tương đối: (%) ( 1)* *100
x S t x n
e. Định lượng Berberin clorid bằng phương pháp đo UV – Vis theo DĐVN III
- Dung dịch thử: cân chính xác một lượng bột nguyên liệu tương ứng với 40mg berberrin clorid thêm 10ml nước cất để thấm đều bột, sau đó thêm khoảng 200ml nước sôi, khuấy 5 phút hoặc siêu âm cho tan, để nguội rồi chuyển vào bình định mức 250ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều. Để lắng, lọc qua giấy lọc. Lấy chính xác 5ml dịch lọc pha loãng với nước cất vừa đủ 100ml [4].
Dung dịch chuẩn: dùng chất đối chiếu berberin clorid chuẩn, pha tương tự dung dịch thử.
- Mẫu trắng: nước cất.
- Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn trong cùng điều kiện tại bước sóng cực đại 353 ± 1nm, cốc đo dày 1cm.
Cách tính: lượng Berberin clorid được tính bằng: % 100 * * * * (%) Cc mt Ac mc At X Trong đó: - At là độ hấp thu mẫu thử,
- mt là khối lượng mẫu thử
- mc là khối lượng mẫu chuẩn
- Cc là hàm lượng chất chuẩn đối chiếu.
Có thể sử dụng một trong hai phương pháp cho quá trình xác định hàm lượng berberin clorid trên cơ sở phù hợp với các yêu cầu thực nghiệm.
2.2.2. Phương pháp tinh chế berberin clorid và kiểm tra chất lượng
Quá trình tinh chế berberin clorid được tiến hành qua nhiều công đoạn, mỗi công đoạn có nhiều điều kiện và yếu tố kỹ thuật khác nhau.
a. Phương pháp xác định độ tan của berberin trong dung môi tinh chế
* Nguyên tắc: thực hiện các thí nghiệm ở cùng điều kiện nhiệt độ và khuấy trộn khi cân chính xác 1 lượng nguyên liệu Berbrin clorid cho vào một thể tích dung môi cần tinh chế để thu được một loạt các dung dịch bão hòa. Lọc dịch thu được và tiến hành định lượng xác định hàm lượng hoạt chất tan trong dung dịch bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc bằng phương pháp quang phổ hấp thụ.
* Tiến hành: chuẩn bị 3 mẫu cân, cân chính xác mỗi mẫu 1 gam nguyên liệu Berberin clorid ban đầu lần lượt cho vào 3 bình nón 250ml, thêm 100 ml mỗi loại dung môi vào bình nón 250ml đó. Tiến hành lắc trên thiết bị lắc ngang với tốc độ 60 lần trên phút, điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ, lọc lấy dịch lọc, hút chính xác 1ml dịch lọc cho vào bình định mức 50ml, thêm dung môi pha động đến vạch. Lọc qua màng 0,45 μm rồi tiến hành định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc phương pháp quang phổ UV-Vis.
Sử dụng kết quả phân tích để chọn dung môi dùng tinh chế.
b. Tinh chế
Từ nguyên liệu berberin 50% tiến hành tinh chế bằng cách kết tinh lại trong nước hoặc ethanol, tẩy màu bằng than hoạt tính. Sơ đồ tinh chế được trình bày ở Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid bằng ethanol
Qua tham khảo tài liệu và tiến hành một số thí nghiệm sơ bộ tôi nhận thấy
Nguyên liệu Berberin clorid (50 %) -Nước cất nóng 600C
-Than hoạt tính
-Khuấy
-Siêu âm tầng số 50Hz
Dịch lọc
Tủa Berberin clorid
-Kết tinh -Lọc chân không -Sấy Bỏ bã thực hiện 2 lần NaCl rắn (1%) Bỏ dịch lọc -Cồn tuyệt đối
-Than hoạt tính, nhiệt độ
Dịch lọc Bỏ bã
Berberin clorid khan
thực hiện 3 lần
berberin có thể được tinh chế bằng cách tẩy màu bằng than hoạt tính và kết tinh lại trong ethanol. Vì vậy, tôi tiến hành tinh chế berberin theo phương pháp kết tinh lại trong dung môi ethanol 96%, nước cất.
Tiến hành theo các bước như sau:
- Bước 1: Cân chính xác 2,0 gam nguyên liệu berberin clorid thô hòa tan trong
200 ml dung môi. Thêm 0,1 gam than hoạt tính. Đun hồi lưu cách thủy ở 80 0C trong
30 phút. Song song chuẩn bị dung môi tinh chế ở cùng điều kiện nhiệt độ. Tiến hành lọc nóng trên phễu Buchner để loại than hoạt tính, tráng dụng cụ bằng 100 ml dung môi. Tiến hành cất cô quay chân không đến khi thể tích trong bình thủy tinh còn lại khoảng 200ml. Đậy kín bình thủy tinh có dịch tinh chế bằng màng nilon, để kết tinh qua đêm ở ngăn mát của tủ lạnh hoạt động. Lọc lấy tinh thể trên phễu Buchner. Sấy tinh thể trong tủ sấy áp suất giảm ở 800C trong 12 giờ. Xác định hàm lượng berberin clorid trong sản phẩm tinh chế theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần, lấy kết quả trung bình.
c. Kiểm tra chất lượng sản phẩm sau tinh chế.
Sản phẩm sau khi tinh chế được kiểm tra chất lượng theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV và đo phổ hồng ngoại.
2.2.3. Phương pháp bào chế nano berberin
a. Bào chế hỗn dịch nano berberin
Trên nguyên tắc sử dụng phương pháp “Top – down”, tham khảo tài liệu kết hợp với một số khảo sát sơ bộ, hệ tiểu phân nano berberin được tiến hành bào chế theo công thức cơ bản được trình bày ở Bảng 2.1 và sơ đồ nghiên cứu tổng quát được thể hiện ở Hình 2.2.
Bảng 2.1. Công thức thành phần bào chế hỗn dịch nano berberin
Nguyên liệu Khối lượng gam Mức độ
Berberin clorid (trên 90%) 1 chính xác
Chất diện hoạt 0,2 thay đổi
Chất ổn định 0,2 thay đổi
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát để bào chế hỗn dịch nano berberin
Mô tả chi tiết quy trình bào chế:
- Cân berberin sau khi tinh chế và chất diện hoạt theo đúng tỉ lệ.
- Thực hiện nghiền ướt bằng chày cối mã não để tạo hỗn dịch đặc, chú ý tránh
làm tăng nhiệt độ gây trương nở.
- Thêm từ từ tá dược đồng diện hoạt và tiếp tục nghiền.
- Chuyển hỗn hợp thu được vào cốc thủy tinh, thực hiện đồng thời vừa khuấy
vừa đánh siêu âm ở tầng số 50Hz cùng lúc. Chú ý làm lạnh nước trong bể siêu âm.
- Từ từ cho thêm nước cất vào cho đến 100ml, đồng thời sử dụng lực phân cắt
lớn bằng máy đồng nhất hóa với tốc độ 2000 vòng / phút trong thời gian 15 phút. Thu được hỗn dịch, tiến hành đo kích thước hạt, đo quang phổ, định lượng hàm lượng berberin clorid.
b. Phun sấy
Sau khi đo kích thước tiểu phân hỗn dịch nano berberin bào chế đạt kích thước thích hợp thì tiến hành phun sấy hỗn dịch để tạo thành dạng bột, thuận tiện trong việc nghiên cứu, bảo quản và sử dụng.
Tiến hành:
Berberin clorid Chất diện hoạt
Khuấy đều Hỗn hợp A Khuấy đều Hỗn hợp B Chất đồng diện hoạt Nước cất Khuấy đều Hỗn dịch nano
Hòa tan tá dược đóng vai trò là chất mang như aerosil, PVP K30, với nồng độ khoảng 10 % khối lượng trên thể tích trong ethanol 96%.
Kết nối thiết bị phun sấy, thực hiện cài đặt quy trình với các thông số: - Nhiệt độ khí vào 80 0C
- Nhiệt độ khí ra 70 0C - Tốc độ gió thổi 50 m3/ giờ,
- Áp lực phun 0,3 bar
- Thể tích phun 5 ml /phút.
Đến khi hết dịch phun thì vẫn tiếp tục sấy thêm 30 phút, để nguội khối bột đến
nhiệt độ khoảng 40 0C. Sau đó cho vào túi nilong, buộc kín miệng bao, bảo quản và
thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.4. Đánh giá hình thái và kích thước hệ nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (transmission electron microscopy) truyền qua TEM (transmission electron microscopy)
Mắt người bình thường có thể quan sát những vật nhỏ nhất khoảng 1mm. Với các vật nhỏ hơn, chúng ta cần tới các công cụ hỗ trợ như kính hiển vi quang học hoặc kính hiển vi điện tử. Kính hiển vi điện tử thì được chia làm loại quét (SEM) và truyền qua (TEM).
Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (transmission electron microscopy), là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao
chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số [21].
Cấu tạo và nguyên lý làm việc của kính hiển vi điện tử truyền qua
Đối tượng sử dụng của TEM là chùm điện tử có năng lượng cao, vì thế các cấu kiện chính của TEM được đặt trong cột chân không siêu cao được tạo ra nhờ các hệ bơm chân không (bơm turbo, bơm iôn..).
* Súng phóng điện tử
Trong TEM, điện tử được sử dụng thay cho ánh sáng (trong kính hiển vi quang học). Điện tử được phát ra từ súng phóng điện tử. Có hai cách để tạo ra chùm điện tử:
+ Sử dụng nguồn phát xạ nhiệt điện tử:
Điện tử được phát ra từ một catốt được đốt nóng (năng lượng nhiệt do đốt nóng sẽ cung cấp cho điện tử động năng để thoát ra khỏi liên kết với kim loại. Do bị đốt nóng nên súng phát xạ nhiệt thường có tuổi thọ không cao và độ đơn sắc của chùm điện tử thường kém. Nhưng ưu điểm của nó là rất rẻ tiền và không đòi hỏi chân không siêu cao. Các chất phổ biến dùng làm catốt là W, Pt, aB6…
+ Sử dụng súng phát xạ trường (Field Emission Gun, các TEM sử dụng nguyên
lý này thường được viết là FEG TEM):
Điện tử phát ra từ catốt nhờ một điện thế lớn đặt vào vì thế nguồn phát điện tử