6. Bố cục của luận văn
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BẰNG SEM VÀ TEM
3.4.1. Kích thước tiểu phân berberin clorid
Sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) quan sát mẫu nano berberin nghiên cứu và đối chứng với mẫu berbrin clorid tinh chế được pha cùng nồng độ bằng nước cất.
Đối với nguyên liệu berberin sau tinh chế, khi pha trong môi trường nước và soi kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần thì ta thấy nhiều hình dạng khác nhau và chủ yếu là tinh thể hình kim với với kích thước không đồng nhất khoảng từ 1-100 μm. Trong khi đó, kích thước hạt hỗn dịch nano được trình bày ở Hình 3.8.
Hình 3.8. Hình ảnh tiểu phân của nano berbein clorid khi qua sát dưới kính hiển vi điện tử
Kết quả phân tích SEM cho thấy trong hỗn dịch nano berberin có các tinh thể có kích thước từ 10nm đến 200 nm. Hình ảnh khá mờ với các khối vô định hình, điều này có thể được hiểu do công thức phân tử berberin khá lớn nên khi được bọc bởi các chất diện hoạt sẽ khó tạo một hình lập thể hoàn chỉnh. Ngoài ra, trong quá trình bào chế chúng tôi có sử dụng thiết bị siêu âm do đó có thể làm thay đổi hình dạng tiểu phân nano berberin. Như vậy, quá trình bào chế đã làm giảm kích thước tiểu phân xuống khoảng 100 lần.
tinh chế và bột sấy phun berberin. Kết quả hình ảnh được trình bày ở Hình 3.9 cho thấy có sự thay đổi cơ bản về hình ảnh tinh thể.
(a) (b)
Hình 3.9. Hình ảnh tiểu phân khi chụp TEM mẫu bột berberin clorid tinh chế (a) và bột berberin sấy phun (b).
Kết quả phân tích hình ảnh bột berberin clorid tinh chế chủ yếu là tinh thể hình kim có cấu trúc chắc chắn, kích thước hạt không đồng nhất từ 1 μm đến 5 μm. Kết quả này phù hợp với điều kiện thí nghiệm là các mẫu berberin tinh chế thành công được nghiền qua thiết bị nghiền bi.
Kích thước hạt của bột phun sấy berberin chủ yếu trong khoản 2μm đến 10 μm. Điều này là do các tiểu phân bị kết tụ với nhau trong quá trình bào chế, nước bị tách ra, các chất diện hoạt và đồng diện hoạt gắn kết vào và các lớp tá dược bao bọc quanh các tiêu phân đã làm cho kích thước hạt tăng lên.
Nhận xét:
- Thông qua các kết quả đo SEM và TEM tôi nhận thấy bước đầu đã bào chế
được hỗn dịch nano berberin với kích thước hạt tiểu phân chủ yếu dao động từ 100nm – 200nm. Kích thước này đã giảm 100 lần so với kích thước hạt nguyên liệu berberin ban đầu.
- Sau khi phun sấy hỗn dịch đã thu được sản phẩm tinh thể berberin có kích
thước nano. Với việc bào chế nano berberin được thực hiện theo phương pháp Top – Down cần nhiều thiết bị chuyên dụng. Việc chủ động tiến hành nhiều thí nghiệm trên nền tảng thời gian và trang thiết bị có hạn cũng là một khó khăn cho tính liên tục của nghiên cứu. Đặt biệt là công đoạn đo kích thước hạt nano, là cơ sở cho việc điều chỉnh
công thức, tỉ lệ thành phần hoạt chất và các tá dược cho phù hợp.
- Nghiên cứu tạo hỗn dịch nano berberin đã mang lại ứng dụng khá lớn vì đã
đáp ứng được rất nhiều nhu cầu của ngành Dược để sản xuất các dạng bào chế thuốc nước mà trong đó berberin clorid là thành phần chính.
3.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng chất diện hoạt đến kích thước hạt nano
Theo phương pháp nghiên cứu bào chế nano theo mục 2.3.3. Chúng tôi tiến hành 2 thử nghiệm khác nhau khi thêm chất diện hoạt Tween 80 và đồng diện hoạt vào quá trình bào chế.
Thử nghiệm 1: cho Tween 80 nguyên chất trực tiếp từ từ vào nguyên liệu berberin clorid và tiến hành nghiền bi.
Thử nghiệm 2: pha dung dịch Tween 80 nồng độ 10% (pha trong nước cất) từ từ vào nguyên liệu berberin clorid. Các giai đoạn tiếp theo thực hiện đúng quy trình. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của chất diện hoạt đến kích thước tiểu phân được trình bày ở Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất diện hoạt đến kích thước tiểu phân
Thành phần Kết quả Mẫu Berberin (gam) Tween 80 (gam) PVP K30 (gam) Dung dịch Tween 80 10% (gam) Dung dịch PVP K30 10%(gam) Đánh giá cảm quan, kích thước TN 1 1 0,2 0,2 0 0 Màu vàng, đồng nhất, 50 -100 nm TN2 1 0 0 0,2 0,2 Màu vàng, đồng nhất, 10 -50 nm Nhận xét: Việc khảo sát này với mục đích xem xét khả năng thấm ướt của nguyên liệu tương tự như quá trình nghiền khô và nghiền ướt. Từ số liệu Bảng 3.9 cho thấy quá trình thấm ướt một phần nguyên liệu sẽ cho kết quả hạt tiểu phân nhỏ hơn (kích thước hạt từ 10μm-50μm) so với trường hợp cho trực tiếp chất diện hoạt
vào nguyên liệu. Điều này được giải thích do sự có mặt của nước làm cho quá trình trương nở nguyên liệu tăng lên, dẫn đến ma sát nghiền tăng, tăng các khoảng trống trong phân tử, giúp các phân tử dễ tách nhau ra làm cho kích thước hạt tiểu phân giảm.
3.4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ đồng nhất hóa
Thực hiện khảo sát bào chế theo CT1và CT2 (theo mục 3.3.1.) trong điều kiện thay đổi tốc độ đồng nhất hóa trên thiết bị IKA T25 khi tăng dần tốc độ: 8000; 12000; 16000; 20000; 24000 vòng/phút để nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ đồng nhất hóa đến kích thước tiểu phân. Cố định thời gian đồng nhất hóa là 15 phút, kết quả thí nghiệm sau khi đo kích thước tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.10 và sự ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa mẫu đến kích thước tiểu phân được mô tả qua Hình 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa đến kích thước tiểu phân.
Công thức bào chế Tốc độ đồng nhất hóa (vòng/phút) Kết quả (nm) CT1 8000 815 CT2 803 CT1 12000 650 CT2 630 CT1 16000 450 CT2 424 CT1 20000 240 CT2 210 CT1 24000 112 CT2 103
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tốc độ đồng hóa đến kích thước tiểu phân
Nhận xét: dựa công thức bào chế CT1 và CT2 nó chỉ khác nhau lượng chất diện hoạt và đồng diện hoạt nhưng có ý nghĩa rất lớn khi bào chế hình thành tiểu phân nano. Bằng cách tăng dần tốc độ đồng nhất hóa ta có thể thấy kích thước tiểu phân giảm dần. Tại tốc độ 16000 đến 20000 thì kích thước tiểu phân dao động 200 - 400 nm. Với kích thước này thì hệ tiểu phân hình thành khá ổn định về thể chất. Vì vậy khi tăng tốc độ lên 24000 vòng /phút thì kích thước tiểu phân có giảm xuống khoảng 100nm, tuy nhiên cần có thêm nghiên cứu về độ ổn định của hệ này. Vì kích thước tiểu phân càng nhỏ thì diện tích bề mặt tiểu phân càng lớn, năng lượng hoạt động lớn, nên khả năng hoạt động hỗn loạn và va chạm tăng lên, kết quả có thể phá vỡ cấu trúc hệ tiểu phân, dễ gây hiện tượng kết tụ và sa lắng.
3.5. KẾT QUẢ THỬ ÐỘ HÒA TAN CỦA TINH THỂ NANO BERBERIN
Sau khi sấy phun hỗn dịch nano berberin clorid tạo bột berberin, sản phẩm được đánh giá khả năng hòa tan trong dung môi thông qua thiết bị thử độ hòa tan Erweka DT.
3.5.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng berberin
Nhằm đáp ứng yêu cầu phân tích nhanh hàm lượng berberin clorid trong khảo sát độ hòa tan berberin clorid, tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn định lượng berberin clorid theo phương pháp UV –Vis (theo mục 2.3.5.)
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 CT1- 8000 CT2- 8000 Công thức – tốc độ (vòng /phút)
Các phép đo quang được tiến hành trên các mẫu dung dịch berberin chuẩn có nồng độ tăng dần:
M1= 0,002mg/ml; M2= 0,003mg/ml; M3= 0,004mg/ml; M4= 0,005mg/ml; M5= 0,006mg/ml; M6= 0,007mg/ml; M7=0,008mg/ml; M8=0,009mg/ml tại khoảng bước sóng 240-400 nm. Cực đại hấp thu 353 nm ± 1nm. Thiết bị quang phổ UV-Vis Ultrospess 7000PC, kết quả đo được thể hiện ở Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn berberin clorid
Tên mẫu Nồng độ (mg/ml) Độ hấp thu (λmax= 354nm) M1 0,002 0,186 M2 0,003 0,222 M3 0,004 0,295 M4 0,005 0,381 M5 0,006 0,462 M6 0,007 0,540 M7 0,008 0,597 M8 0,009 0,650
Thực hiện trên công cụ excel ta thiết lập đường chuẩn thể hiện mối tương quang giữa nồng độ dung dịch berberin clorid với độ hấp thụ.
Phương trình tuyến tính có dạng:
Y= aX + b Trong đó:
X: là nồng độ berberin trong dung dịch (mg/ml) Y: là độ hấp thụ đo được
Ứng dụng định luật Lamber Beer, ta có thể tính nồng độ của mẫu dung dịch berberin khi biết độ hấp thụ.
Hình 3.11. Phương trình đường chuẩn berberin clorid
Phổ hấp thụ của berberin clorid có 2 cực đại tại bước sóng 270nm và 354nm được trình bày ở Hình 3.12.
Hình 3.12. Phổ hấp thụ UV-Vis của berberin clorid
3.5.2. Độ hòa tan của tinh thể nano berberin.
Thực hiện thí nghiệm khảo sát trên thiết bị thử độ hòa tan Ewerka DT 50. Mẫu thử 1 là nguyên liệu berberin 95% và mẫu thử 2 là sản phẩm tinh thể nano berberin clorid (theo mục 2.3.6)
Thông số cài đặt:
- Thiết bị thử độ hòa tan Erweka-DT: giỏ quay, tốc độ 100 vòng /phút
- Môi trường hòa tan: 900ml dung dịch Tween 80 với nồng độ 0,2%.
- Nhiệt độ môi trường hòa tan: 37 0C ± 0,5 0C.
y = 0.0707x + 0.0278 R² = 0.9931 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 2 4 6 8 10 Độ hấ p thụ Nồng độ dung dịch
- Khối lượng mẫu thử: tương ứng 45mg hoạt chất / giỏ quay
- Sau khi đo được độ hấp thụ của dung dịch theo thời gian, thế vào phương trình
tuyến tính ở mục 3.5.1, ta sẽ xác định được nồng độ (mg/ml) của hoạt chất. Từ đó ta lập bảng so sánh độ tan và tốc độ hòa tan của hoạt chất trong 2 mẫu thí nghiệm.
Kết quả độ tan của nguyên liệu berberin clorid và tinh thể nano berberin theo thời gian được trình bày trong Bảng 3.12. Trong đó hàm lượng tối đa hoạt chất trong dung dịch là 0,05 mg/ml.
Bảng 3.12. Độ hòa tan trong nước của nguyên liệu berberin 95% và tinh thể nano berberin
Thời gian (phút) Hàm lượng (mg/ml) Hàm lượng tối đa (0,05mg/ml) Nguyên liệu berberin
clorid (Mẫu thử 1) Tinh thể nano berberin (Mẫu thử 2) 10 0,0055 0,0102 20 0,0094 0,0118 30 0,0112 0,0153 40 0,0130 0,0205 50 0,0156 0,0357 60 0,0163 0,0499 Đạt tối đa 90 0,0205 0,0499 120 0,0404 150 0,0498 Đạt tối đa
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn tốc độ hòa tan trong nước của hoạt chất berberin nguyên liệu và berberin sau khi sấy phun
0.0000 0.0200 0.0400 0.0600 0 50 100 150 200 Hàm lượng (m g/m l) Thời gian ( phút)
Độ hòa tan trong nước của berberin nguyên liệu và tinh thể nano sấy phun
Nguyên liệu Tinh thể nano
Nhận xét: nhìn vào đồ thị Hình 3.13. ta thấy:
- Từ thời gian từ 0 phút đến 60 phút thì mẫu tinh thể nano berberin đã đạt nồng
độ tối đa (0,05mg/ml) trong khi đó mẫu nguyên liệu berberin đạt 0,016 mg/ml. Điều này cho thấy khả năng hòa tan của sản phẩm phun sấy nano berberin cao gấp 3 lần so với nguyên liệu.
- Thời gian hòa tan để đạt nồng độ tối đa của mẫu thử 02 là 60 phút, mẫu thử 01
là 150 phút, điều này cho thấy tốc độ hòa tan của mẫu thử 02 cao gấp 2,5 lần so với mẫu thử 01.
Từ các số liệu thực nghiệm thu được có thể khẳng định mức độ và tốc độ hòa tan của mẫu nano berberin sấy phun cao hơn mẫu berberin tinh chế. Điều này có thể được giải thích do có sự cải thiện kích thước hạt tinh thể đến mức nanomet, trong quá trình bào chế chúng ta đã có những tác động vật lý, hóa học làm chuyển đa số cấu trúc tinh thể berberin ban đầu (hình que) thành dạng vô định hình, giảm năng lượng hoạt động bề mặt, tăng khả năng hòa tan berberin clorid trong nước. Ngoài ra dưới các tác động của chất diện hoạt và đồng diện hoạt giúp đóng gói các phân tử berberin ở mức độ nano nó cũng cải thiện độ tan của berberin clorid.
Kết quả bào chế thành công nano berberin đã khắc phục được các nhược điểm của berberin clorid là vị đắng và cải thiện được độ tan của berberin clorid trong nước.
3.6. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TRƯỞNG VI SINH VẬT CỦA HỆ NANO BERBERIN BERBERIN
3.6.1. Tính ức chế sinh trưởng của nano berberin đối với chủng E.coli và Staphylococcus. Staphylococcus.
Qua tham khảo tài liệu và tiến hành các thí nghiệm sơ bộ nhằm khảo sát đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật của berberin clorid. Tôi tiến hành các thí nghiệm trên các đĩa thạch có cấy các chủng vi sinh vật, sau đó sử dụng phương pháp đục lỗ để xác định khả năng kháng khuẩn. Kết quả hình ảnh các vòng kháng khuẩn trên đĩa thạch được trình bày ở Hình 3.14.
a b c
d e f
Hình 3.14. Kết quả thí nghiệm khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật của dung dịch nano berberin
a - E.coli cho nano berberin CT1 b - E.coli cho nano berberinCT2 c - E.coli (gram âm) đối chứng
d - Staphylococcus cho nano berberin CT1 e - Staphylococcus cho nano berberin CT2 f - Staphylococcus ( gram dương) đối chứng
- Kết quả đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật của hỗn dịch nano
berberin được trình bày ở Bảng 3.13.
Bảng 3.13. Khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật của hỗn dịch nano berberin
STT Tên mẫu E.coli Staphylococcus Kết quả
1 Hệ nano berberin CT1(a,d) + + Có ức chế
2 Hệ nano berberin CT2(b,e) + + Có ức chế
3 Mẫu trắng (c,f) - - Không ức chế
Tiến hành đo vòng kháng khuẩn ta thấy cả hai mẫu nano berberin đều cho kết quả ức chế sinh trưởng với cả hai loại vi khuẩn.
Tuy nhiên mẫu nano berberin CT1 thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật tốt hơn mẫu nano berberin CT2. Sau 36 giờ nuôi cấy với mẫu CT1 tạo vòng kháng
khuẩn khoảng 2,2cm với E.coli và khoảng 2,0cm với Staphylococcus. Mẫu nano CT2
tạo vòng kháng khuẩn tương ứng là 1,5cm với E.coli và 1,3cm với Staphylococcus.
Theo kết quả đó, ta có thể kết luận bước đầu là hỗn dịch nano berberin 0,1mg/ml điều chế được có khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật E.coli, Staphylococcus.
3.6.2. Tính ức chế sinh trưởng vi sinh vật của nano berberin đối chứng với nguyên liệu berberin clorid nguyên liệu berberin clorid
Thử nghiệm trên hai chủng vi sinh vật là Escherichia Coli BL21 và Bacillus
licheniformis.
Kết quả thử nghiệm đối chứng giữa nano berberin và nguyên liệu berberin về khả năng ức chế sự phát triển vi sinh vật được trình bày ở Hình 3.15.
a. b.
Hình 3.15. Khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật giữa nano berberin và nguyên liệu berberin
Trong đó:
a: môi trường Escherichia Coli BL21 (vi khuẩn gram âm)
b: môi trường Bacillus licheniformis (vi khuẩn gram dương)
Nhận xét: trên đĩa thử nghiệm (a) có cấy vi sinh vật E.coli kích thước vòng
kháng khuẩn của chất kháng sinh penicilin là 1,5cm, của hệ nano berberin là 1,2cm, còn vòng kháng khuẩn của berberin nguyên liệu thì không rỏ ràng. Điều này cho thấy hệ nano berberin điều chế được có tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vật E.coli
kém hơn khả năng ức chế vi sinh vật của penicilin có cùng nồng độ.
Ở đĩa thử nghiệm (b) có cấy vi sinh vật Bacillus kích thước vòng kháng khuẩn
của kháng sinh penicilin là 2,1cm là rất lớn so với vòng kháng vi sinh vật của nano berberin là 0,8 cm. Còn vòng kháng khuẩn của nguyên liệu berberin thì không thấy xuất hiện. Kết quả đánh giá mẫu đối chứng trên cùng một đĩa thạch được trình bày ở Bảng 3.14
Bảng 3.14. Kết quả so sánh về tính ức chế sinh trưởng vi sinh vật của nguyên liệu berberin và hệ nano berberin.
STT Tên mẫu E.coli Bacillus Kết quả
1 Hệ nano berberin + + Có ức chế
2 Nguyên liệu Berberin - - Không
3 Penicilin + + Có ức chế
Nhận xét: hệ nano berberin có gây tác dụng ức chế sinh trưởng đối với chủng vi sinh vật Escherichia Coli BL21 và Bacillus licheniformis.
3.6.3. Tính ức chế sinh trưởng của nano berberin đối chứng với sản phẩm viên nén Berberin BM 5mg