6. Bố cục của luận văn
3.1. ÐỊNH LƯỢNG BERBERIN CLORID TRONG NGUYÊN LIỆU
3.1.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: cân chính xác 0,01 gam chất chuẩn berberin clorid, hòa tan trong pha động vừa đủ 100ml. Đánh siêu âm hòa tan mẫu, lọc qua màng lọc 0,45μm.
Tiêm mẫu 6 lần qua cột sắc ký với các điều kiện ghi như ở mục 2.3.1, kết quả diện tích pic (Spic), thời gian lưu (tR) được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký
STT Spic tR 1 3147447 9,42 2 3149708 9,41 3 3147758 9,40 4 3149043 9,39 5 3147611 9,38 6 3150485 9,38 Trung bình 3148675,33 9,4 RSD % 0,04 0,17
Nhận xét: điều kiện sắc ký lỏng cao áp cho độ lặp lại tốt về thời gian lưu, diện tích pic với độ lệch chuẩn RSD< 2%, vì vậy hệ thống sắc ký trên đảm bảo được tính thích hợp với quy trình định lượng berberin clorid.
Hình ảnh sắc ký đồ của berberin clorid chuẩn được trình bày ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Sắc ký đồ của Berberin clorid chuẩn
3.1.2. Kết quả định lượng berberin thô
Nguyên liệu berberin clorid được cung cấp bởi Công ty Dược Vĩnh Kim. Tiến hành:
- Chuẩn bị 2 bình định mức 100 ml, rửa sạch, sấy khô.
- Cân chính xác 0,01 gam berberin clorid cho vào bình địch mức 100ml.
- Cho dung môi pha động vào các bình định mức và định mức tới vạch, đánh
siêu âm cho tan hết berberin clorid. Tiến hành lọc dịch qua phin lọc 0,45μm, chuyển dịch lọc vào vial.
- Đưa các vial vào máy và tiến hành định lượng HPLC theo mục 2.3.1. Kết quả định lượng berberin clorid được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lượng berberin hydroclorid (C20H18NO4Cl) trong nguyên liệu ban đầu
TT Hàm lượng berberin clorid %
Hàm lượng berberin clorid tính trên chế phẩm làm khan % (độ ẩm 10%)
1 48,67 54,07
2 47,99 53,32
Trung bình 48,33 53,69
Nhận xét:
Hàm lượng berberin hydroclorid của nguyên liệu khảo sát là 53,69 %, như vậy nguyên liệu khảo sát chưa đạt tiêu chuẩn chất lượng theo DĐVN IV.
3.2. TINH CHẾ BERBERIN CLORID VÀ KẾT QUẢ ÐỊNH LƯỢNG
3.2.1. Ảnh hưởng của bản chất dung môi, nhiệt độ, thời gian đến khả năng tan berberin clorid berberin clorid
Thông qua các tài liệu thu thập được và tiến hành một số thí nghiệm sơ bộ chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ và thời gian đến độ tan của berberin clorid.
a. Ảnh hưởng của dung môi đến độ tan của berberin clorid
Tiến hành thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi đến độ tan của berberin clorid với 3 mẫu thử, mỗi mẫu 2 gam, thể tích dung môi 100ml, thời gian 60 phút, nhiệt độ 500C. Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến độ tan của berberin clorid
STT Nước cất Ethanol 50 % Ethanol 96%
1 Tan rất ít Tan ít Tan
2 Tan rất ít Tan ít Tan
3 Tan rất ít Tan ít Tan
Nhận xét: qua thí nghiệm trên 3 mẫu xác định được berberin tan tốt trong ethanol 96 %.
b.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ tan của berberin clorid
Tiến hành với 3 mẫu thử, mỗi mẫu 2 gam berberin clorid, thể tích dung môi 100ml, thời gian 60 phút.
Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ tan của berberin clorid
Dung môi
Nhiệt độ Nước cất Ethanol 50 % Ethanol 96%
50 0C Tan rất ít Tan ít Tan
70 0C Tan rất ít Tan ít Tan nhiều
90 0C Tan Tan Tan nhiều
Nhận xét: qua quá trình khảo sát, ta thấy nhiệt độ tăng làm tăng khả năng tan của berberin clorid.
c. Ảnh hưởng của thời gian đến độ tan của berberin clorid
Tiến hành thí nghiệm với 3 mẫu thử, mỗi mẫu 2 gam berberin clorid trong 3
dung môi, thể tích dung môi 100ml, nhiệt độ 30 0C. Sau 90 phút lấy mẫu một lần để
kiểm tra hàm lượng berberin clorid. Kết quả hàm lượng berberin được trình bày ở Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả hàm lượng berberin clorid tan trong dung dịch theo thời gian
Dung môi
Thời gian Nước cất Ethanol 50 % Ethanol 96%
90 phút 13,5 % 27,2 % 30,5 %
180 phút 15,8 % 32,7 % 41,0 %
270 phút 19,6 % 40,5 % 48,2 %
Nhận xét: Từ kết quả ở Bảng 3.5, ta thấy độ tan của berberin clorid tăng theo thời gian và tốc độ tan khác nhau ở từng dung môi. Cụ thể trong dung môi nước thì độ tan chậm, trong dung môi ethanol 96% thì độ tan và tốc độ hòa tan hoạt chất tăng nhanh theo thời gian.
Kết hợp các yếu tố dung môi, nhiệt độ, thời gian ảnh hưởng đến độ tan và tốc độ hòa tan berberin clorid tôi lựa chọn các điều kiện cho quá trình tinh chế berberin clorid như sau:
- Mẫu berberin clorid nguyên liệu ban đầu: 2 gam
- Dung môi ethanol 96%
- Nhiệt độ: 70 0C - Thời gian: 3 giờ
- Tác động cơ học: khuấy, siêu âm.
3.2.2. Tinh chế berberin clorid
Sau khi thu thập tài liệu và tiến hành các thí nghiệm sơ bộ, tôi tiến hành tính chế berberin clorid theo sơ đồ được trình bày ở Hình 3.2.
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid bằng Ethanol 96%
Dịch lọc
thực hiện 2 lần Nguyên liệu berberin clorid (50%), 2 gam
- Ethanol (96%), 700C -Than hoạt tính 5% khối lượng so với nguyên liệu
- Dd HCl 0,1N (1%) so với thể tích ethanol 96%
- Siêu âm tầng số 50 Hz, thời gian 15 phút - Khuấy, đun hồi lưu cách thủy
Tủa berberin clorid
-Kết tinh, lọc -Sấy áp suất giảm
Bỏ bã
- Hạ nhiệt độ
- Để lắng, lọc chân không
Bỏ dịch lọc
Kết quả tinh chế berberin clorid dạng bột màu vàng đặc trưng, thể chất đồng nhất. Hình ảnh berberin clorid nguyên liệu ban đầu được trình bày ở Hình 3.3 và berberin sau tinh chế được trình bày ở Hình 3.4.
Hình 3.3. Berberin nguyên liệu Hình 3.4. Berberin tinh chế
Kết quả xác định hàm lượng berberin clorid sau khi tinh chế được trình bày ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Hàm lượng berberin hydroclorid (C20H18NO4Cl) sau khi tinh chế
Dung môi Khối lượng berberin thô (gam) Khối lượng berberin kết tinh (gam) Độ ẩm (%) Hàm lượng berberin clorid tính theo chế phẩm khan (%) Hiệu suất tinh chế (%) Ethanol 96 % 2,00 0,915 10,0 99,83 85,10
Nhận xét: Theo kết quả khi tinh chế thì hàm lượng berberin clorid ứng với dung môi ethanol 96 % đạt 99,83 %. Kết quả định lượng đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt
Nam IV (chứa 95,0% đến 102,0% C20H18NO4Cl, tính theo chế phẩm đã làm khô).
Thực tế cho thấy, quá trình tinh chế có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới quy trình, các yếu tố như dụng cụ thí nghiệm, thiết bị, kích thước hạt than hoạt tính, thời gian đun hồi lưu, thời gian để kết tinh, thất thoát do dụng cụ, sấy, cân…làm giảm hàm lượng và hiệu suất tinh chế.
Giai đoạn tinh chế berberin clorid sử dụng phương pháp kết tinh lại trong dung môi ethanol 96%. Phương pháp này có nhiều ưu điểm: dễ thực hiện, thiết bị dụng cụ
đơn giản, thời gian tinh chế ngắn, hiệu suất cao, thu hồi được dung môi để tái sử dụng. Nhược điểm: sản phẩm có tính bám màu, khó thiết kế thành mô hình khép kín. Dựa trên nguyên lý khi tăng nhiệt độ thì độ tan tăng. Vì vậy để berberin clorid kết tinh trong dung môi tinh chế cần phải giảm dần độ tan của berberin. Giải pháp lựa chọn là tạo ra dung dịch quá bão hòa sau đó giảm nhiệt độ. Dùng than hoạt tính có kích thước phù hợp để tẩy màu. Chú ý kích thước bột than quá mịn sẽ ảnh hưởng đến độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế. Dung môi thực hiện là nước và ethanol rẻ tiền, hòa tan được hoạt chất berberin, ít độc hại.
Với quá trình tinh chế khá đơn giản nhưng cần chú ý đến các công đoạn và yếu tố ảnh hưởng khi nâng cao cỡ mẽ tinh chế như: thiết bị, nhiệt độ, khuấy trộn, rút dịch chiết, gạn, lọc, hút chân không, kết tinh, sấy…
Trong thí nghiệm định lượng berberin bằng phương pháp phân tích quang phổ và sắc ký lỏng cao áp theo Dược diển Việt Nam.
Để nâng cao hiệu suất tinh chế berberin clorid ta có thể tái sử dụng dung dịch lọc sau khi đã lấy phần kết tinh berberin. Tuy nhiên điều này cần nghiên cứu kỹ bởi khả năng có tạp chất và hiệu quả kinh tế mang lại.
Mục đích của quá trình tinh chế là tạo nguyên liệu berberin có hàm lượng cao, tinh khiết cao cho việc nghiên cứu hỗn dịch nano. Vì vậy quy trình tinh chế và kết quả hàm lượng berberin clorid tinh chế đạt yêu cầu cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Kiểm nghiệm berberin clorid đã tinh chế
Quá trình tinh chế sản phẩm berberin clorid được thực hiện 5 lần, mỗi lần dùng 2,0 gam nguyên liệu berberin clorid. Bột berberin clorid tinh chế được gửi mẫu kiểm tra tại trung tâm kiểm nghiệm mỹ phẩm Dược phẩm Đà Nẵng kiểm tra theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV, chuyên luận berberin clorid. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm sản phẩm berberin clorid sau tinh chế
STT Chỉ tiêu và tiêu chuẩn áp dụng theo DĐVN IV Kết quả
1 Tính chất Đạt
2 Định tính Đúng
3 Độ trong Đạt
4 Giới hạn acid Đạt
5 Sulfat (không quá 0,048%) Đạt
6 Kim loại nặng (không quá 30 ppm) Đạt
7 Tạp chất liên quan (phương pháp HPLC) Đạt
8 Nước (8-12%) Đạt (10%)
9 Tro toàn phần (không quá 0,10 %) Đạt
10 Định lượng (phương pháp HPLC, 95,0% đến 102,0%) Đạt (95,45%)
Nhận xét:
- Cảm quang: bột màu vàng, đồng nhất, vị đắng.
- Hàm lượng berberin clorid đạt 95,45% nằm trong khoảng cho phép của Dược
điển Việt Nam IV.
- Sản phẩm berberin tinh chế đạt yêu cầu chất lượng theo Dược điển Việt Nam
IV.
3.2.4. Phổ đồ hồng ngoại (IR)
Sản phẩm berberin clorid sau khi tinh chế đạt hàm lượng trên 95 % được đo phổ hồng ngoại IR trên thiết bị IR Brucker (Công Ty Cổ Phần Dược Danapha), đo trong vùng bước sóng từ 4000-400cm-1. Kết quả được so sánh tự động với phổ chuẩn berberin clorid do Viện kiểm nghiệm cung cấp thì có sự trùng khít 96,82%. Kết quả đo phổ hồng ngoại ở Hình 3.5 và Hình 3.6.
Hình 3.6. Phổ hồng ngoại của berbein clorid tinh chế
Theo Hình 3.6 phổ FTIR của berberin clorid cho thấy sự tồn tại của nhóm
methoxyl (đỉnh 2844,54 cm-1) và đỉnh ở 1624,40 cm-1 được cho là mối quan hệ liên
kết đôi iminium (C=N+) trong phân tử. Hơn nữa, các tín hiệu 1566,43 cm-1 và 1504,06
cm-1 tượng trưng cho sự uốn cong nối đôi C=C và nhóm furyl. Phổ hồng ngoại của
berberin chuẩn cũng xuất hiện các đỉnh tương tự như berberin clorid tinh chế.
Nhận xét: dựa trên kết quả thu được từ phổ IR của berberin tinh chế ta có thể đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế và độ tinh khiết cao của sản phẩm berberin clorid là phù hợp với công thức cấu tạo của berberin clorid.
3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO BERBERIN
3.3.1. Kết quả tạo hỗn dịch nano berberin clorid
Dựa trên phương pháp Top-dow, tham khảo tài liệu và một số thí nghiệm sơ bộ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano berberin theo phương pháp 2.3.3. Sử dụng chất diện hoạt và đồng diện hoạt để tiến hành bào chế hỗn dịch chứa
nguyên liệu là chất hữu cơ ít tan trong nước. Chất diện hoạt có khả năng bọc trên bề mặt của tiểu phân nguyên liệu rắn tạo thành lớp phân cắt pha, đồng thời làm giảm sức căng bề mặt của các tiểu phân này với chất dẫn. Kết quả làm cho các tiểu phân này dễ thấm chất dẫn hơn.
Quá trình nghiên cứu bào chế hệ tiêu phân nano berberin sử dụng chất diện hoạt là Tween 80 và chất đồng diện hoạt PVP K30. Sử dụng công thức bào chế như sau:
Công thức 1 (CT1):
Nguyên liệu Khối lượng gam
Berberin clorid 1
Tween 80 0,1
PVP K30 0,1
Nước cất vừa đủ 100
Công thức 2 (CT2):
Nguyên liệu Khối lượng gam
Berberin clorid 1
Tween 80 0,2
PVP K30 0,2
Nước cất vừa đủ 100
Tiến hành khảo sát CT1 và CT2 để cho thấy sự ảnh hưởng của chất diện hoạt tới kích thước tiểu phân. Kết quả xác định kích thước tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất diện hoạt đến kích thước tiểu phân nano
Thành phần Kết quả Mẫu Berberin (gam) Tween 80 (gam) PVP K30 (gam) Nước cất (ml) Kích thước tiểu phân (nm) CT 1 1 0,1 0,1 100 100 CT2 1 0,2 0,2 100 50
Nhận xét:
- Chất diện hoạt không ion (Twen 80) có khả năng làm giảm sức căng bề mặt
phân cách giữa pha rắn và nước, nó tạo thành màng mỏng đơn và đa phân tử, tạo thành lớp áo bao bọc các tiểu phân phân tán.
- Chất đồng diện hoạt (PVP K30) có vai trò hiệp đồng tác dụng với chất diện
hoạt làm giảm sức căng bề mặt phân cách pha. Làm tăng độ linh hoạt bề mặt phân cách pha, do đó làm tăng entanpy của hệ, thúc đẩy quá trình tạo hỗn dịch nano.
- Vì vậy, khi thay đổi nồng độ của chất diện hoạt và đồng diện hoạt sẽ có ảnh
hưởng lớn đến kết quả tạo hỗn dịch nano. Điều này được lý giải bởi khả năng đóng gói các dược chất trong lòng các chất diện hoạt và đồng diện hoạt.
- Kết quả ở Bảng 3.8. cho thấy CT2 có kích thước tiểu phân nhỏ hơn CT1. Điều này khẳng định sự ảnh hưởng đáng kể của chất diện hoạt và đồng diện hoạt khi thay đổi nồng độ sẽ thay đổi kích thước. Tuy nhiên, cần nhiều khảo sát hơn để kết luận sự phụ thuộc của kích thước tiểu phân vào nồng độ chất diện hoạt.
3.3.2. Phun sấy hỗn dịch nano berberin clorid
Công nghệ phun sấy là chuyển dược chất từ dạng dung dịch thành hoạt chất ở dạng bột bằng cách dùng luồng gió có nhiệt độ cao sẽ bốc hơi dung môi trong hỗn dịch đồng thời dùng các chất mang bao bọc các vi tinh thể hoạt chất. Kết quả tạo được dạng tinh thể chứa hoạt chất có độ ổn định về mặt cơ lý, thuận tiện cho bảo quản và sản xuất. Áp dụng thực tế trên thiết bị phun sấy Spray Dryer SD 05, thu được sản phẩm bột, sau đó rây qua rây số 150 (kích thước lỗ rây 0,15 mm) thì được sản phẩm. Sản phẩm berberin clorid sau khi sấy phun được trình bày ở Hình 3.7.
Nhận xét: bột sấy phun berberin clorid thu được có màu vàng sáng, thể chất đồng nhất. Dạng bào chế tinh thể nano berbrin clorid này được tiếp tục sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo.
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BẰNG SEM VÀ TEM 3.4.1. Kích thước tiểu phân berberin clorid 3.4.1. Kích thước tiểu phân berberin clorid
Sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) quan sát mẫu nano berberin nghiên cứu và đối chứng với mẫu berbrin clorid tinh chế được pha cùng nồng độ bằng nước cất.
Đối với nguyên liệu berberin sau tinh chế, khi pha trong môi trường nước và soi kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần thì ta thấy nhiều hình dạng khác nhau và chủ yếu là tinh thể hình kim với với kích thước không đồng nhất khoảng từ 1-100 μm. Trong khi đó, kích thước hạt hỗn dịch nano được trình bày ở Hình 3.8.
Hình 3.8. Hình ảnh tiểu phân của nano berbein clorid khi qua sát dưới kính hiển vi điện tử
Kết quả phân tích SEM cho thấy trong hỗn dịch nano berberin có các tinh thể có kích thước từ 10nm đến 200 nm. Hình ảnh khá mờ với các khối vô định hình, điều này có thể được hiểu do công thức phân tử berberin khá lớn nên khi được bọc bởi các chất diện hoạt sẽ khó tạo một hình lập thể hoàn chỉnh. Ngoài ra, trong quá trình bào chế chúng tôi có sử dụng thiết bị siêu âm do đó có thể làm thay đổi hình dạng tiểu phân nano berberin. Như vậy, quá trình bào chế đã làm giảm kích thước tiểu phân xuống khoảng 100 lần.
tinh chế và bột sấy phun berberin. Kết quả hình ảnh được trình bày ở Hình 3.9 cho thấy có sự thay đổi cơ bản về hình ảnh tinh thể.