khác nhau
3.3.2. Thu số lượng tế bào lympho B ở chuột gây miễn dịch
3.3.3. Đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0 dùng để dung hợp với tế bào Lympho B bào Lympho B
3.3.4. Sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng bằng phản ứng ELISA 3.3.5. Nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone 3.3.5. Nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone 3.3.6. Xác định nồng độ kháng thể đơn dòng được tạo ra trong dịch báng của chuột BALB/c
3.3.7. Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa kháng thể đơn dòng với các kháng nguyên dòng với các kháng nguyên
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp gây miễn dịch cho chuột thuần chủng BALB/c bằng các kháng nguyên khác nhau kháng nguyên khác nhau
Ba loại kháng nguyên ProgesteroneAntigen, Progesterone-3-BSA Antigen, Progesterone-3-CMO:BSA Antigen được pha loãng với nồng độ khác nhau trong dung dịch PBS 1x vô trùng. Dùng kháng nguyên đã pha loãng để tạo nhũ tương với chất bổ trợ Freund’s Complete Adjuvant (FCA) và Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA) theo tỷ lệ 1:1. Trộn đều để đồng nhất hỗn dịch trong các xi lanh.
Chuẩn bị sẵn một trăm ba mươi lăm chuột BALB/c thuần chủng, khoẻ mạnh không mang thai, độ tuổi tốt nhất là khoảng 6 tuần tuổi được nuôi dưỡng ở điều kiện đảm bảo nhằm phát huy tốt khả năng tạo kháng thể cho chuột được sử dụng để thử khả năng gây miễn dịch của các kháng nguyên, mỗi kháng nguyên thử trên 15 chuột với các nồng khác nhau
Lần lượt gây miễn dịch cho chuột ở 4 nồng độ kháng nguyên khác nhau là 50µg/lần/con, 100µg/lần/con, 200µg/lần/con, 300 µg/lần/con cùng với lô đối chứng không sử dụng kháng nguyên (lặp lại 3 lần, mỗi lần cách nhau 3 ngày)
Trước khi tiêm cần sát trùng vùng bàn chân chuột bằng bông cồn 70o. Khi tiêm các dịch nhũ tương, cần chú ý tránh các mạch máu lớn của chuột. Cung cấp đủ thức ăn, nước uống cho chuột và theo dõi chuột mỗi ngày ít nhất 2 lần. Nếu vết tiêm có dấu hiệu hoại tử cần loại bỏ chuột và gây miễn dịch thay thế cho con khác. Số lượng chuột thí nghiệm được bố trí như sau.
Kháng nguyên Lần thí nghiệm Nồng độ kháng nguyên(µg/lần/con) 0 50 100 200 300 Progesterone Antigen 1 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Progesterone -3- BSA Antigen 1 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Progesterone -3- CMO:BSA Antigen 1 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Chuột được gây miễn dịch theo phương pháp của Kõhler và Milstein (1975), có cải tiến (Liddell and Cryer, 1991) như sau:
- Phối trộn kháng nguyên với các chất bổ trợ FAC (lần đầu tiên) và FAI (lần tiếp theo) theo tỷ lệ 1:1
- Gây miễn dịch cho chuột bằng phương pháp tiêm vào gan bàn chân chuột (lặp lại 3 lần, mỗi lần cách nhau 3 ngày)
- Lấy máu ở tim và thu huyết thanh sau 10 ngày gây miễn dịch để đánh giá khả năng đáp ứng bằng phương pháp ELISA
Hình 3.1. Gây miễn dịch cho chuột BALB/c