3.3.5. Nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone 3.3.6. Xác định nồng độ kháng thể đơn dòng được tạo ra trong dịch báng của chuột BALB/c
3.3.7. Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa kháng thể đơn dòng với các kháng nguyên dòng với các kháng nguyên
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp gây miễn dịch cho chuột thuần chủng BALB/c bằng các kháng nguyên khác nhau kháng nguyên khác nhau
Ba loại kháng nguyên ProgesteroneAntigen, Progesterone-3-BSA Antigen, Progesterone-3-CMO:BSA Antigen được pha loãng với nồng độ khác nhau trong dung dịch PBS 1x vô trùng. Dùng kháng nguyên đã pha loãng để tạo nhũ tương với chất bổ trợ Freund’s Complete Adjuvant (FCA) và Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA) theo tỷ lệ 1:1. Trộn đều để đồng nhất hỗn dịch trong các xi lanh.
Chuẩn bị sẵn một trăm ba mươi lăm chuột BALB/c thuần chủng, khoẻ mạnh không mang thai, độ tuổi tốt nhất là khoảng 6 tuần tuổi được nuôi dưỡng ở điều kiện đảm bảo nhằm phát huy tốt khả năng tạo kháng thể cho chuột được sử dụng để thử khả năng gây miễn dịch của các kháng nguyên, mỗi kháng nguyên thử trên 15 chuột với các nồng khác nhau
Lần lượt gây miễn dịch cho chuột ở 4 nồng độ kháng nguyên khác nhau là 50µg/lần/con, 100µg/lần/con, 200µg/lần/con, 300 µg/lần/con cùng với lô đối chứng không sử dụng kháng nguyên (lặp lại 3 lần, mỗi lần cách nhau 3 ngày)
Trước khi tiêm cần sát trùng vùng bàn chân chuột bằng bông cồn 70o. Khi tiêm các dịch nhũ tương, cần chú ý tránh các mạch máu lớn của chuột. Cung cấp đủ thức ăn, nước uống cho chuột và theo dõi chuột mỗi ngày ít nhất 2 lần. Nếu vết tiêm có dấu hiệu hoại tử cần loại bỏ chuột và gây miễn dịch thay thế cho con khác. Số lượng chuột thí nghiệm được bố trí như sau.
Kháng nguyên Lần thí nghiệm Nồng độ kháng nguyên(µg/lần/con) 0 50 100 200 300 Progesterone Antigen 1 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Progesterone -3- BSA Antigen 1 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Progesterone -3- CMO:BSA Antigen 1 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Chuột được gây miễn dịch theo phương pháp của Kõhler và Milstein (1975), có cải tiến (Liddell and Cryer, 1991) như sau:
- Phối trộn kháng nguyên với các chất bổ trợ FAC (lần đầu tiên) và FAI (lần tiếp theo) theo tỷ lệ 1:1
- Gây miễn dịch cho chuột bằng phương pháp tiêm vào gan bàn chân chuột (lặp lại 3 lần, mỗi lần cách nhau 3 ngày)
- Lấy máu ở tim và thu huyết thanh sau 10 ngày gây miễn dịch để đánh giá khả năng đáp ứng bằng phương pháp ELISA
Hình 3.1. Gây miễn dịch cho chuột BALB/c
3.4.2. Phương pháp thu số lượng tế bào lympho B ở chuột gây miễn dịch
Lách và hạch bẹn của 5 chuột mỗi nhóm có đáp ứng miễn dịch tốt nhất được thu theo phương pháp của Oliver JP.Leger và Jose. Wsaldanha (2000)
Hình 3.2. Thu hạch bẹn chuột Hình 3.3. Thu lách chuột
Hình 3.4. Nghiền nhỏ hạch bẹn và lách chuột
- Giết chuột đã được gây miễn dịch bằng kháng nguyên Progesterone, khử trùng chuột bằng cồn 700C.
- Tách lấy thuỳ lách và các hạch cho vào đĩa petri có chứa 10ml dung dịch PBS. Dùng kéo cắt lách và các hạch thành từng mảnh nhỏ, dùng kẹp gạt nhẹ để các tế bào rơi ra.
- Chuyển hỗn hợp tế bào sang ống ly tâm, đánh tơi tế bào, dùng pipet paster hút lên, đẩy xuống cho cụm tế bào rời nhau ra. Để dung dịch lắng cặn, hút dung dịch tế bào sang ống ly tâm khác. Ly tâm dung dịch tế bào ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ hết dịch nổi và hòa cặn tế bào trong 10ml PBS. Lặp lại thao tác này 3 lần, lần cuối cùng hòa cặn tế bào trong môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS (có mật độ tế bào 109 tế bào/ml).
3.4.3. Phương pháp đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0 dùng để dung hợp với tế bào Lympho B dung hợp với tế bào Lympho B
- Đánh thức và nuôi cấy tế bào MyelomaSp2/0
Chuyển ống tế bào Myeloma Sp2/0 từ Nitơ lỏng sang bể ủ ấm 370C cho rã đông, khử trùng phía ngoài bằng cồn 700C. Dung dịch tế bào được chuyển sang ống ly tâm, tiến hành ly tâm với tốc độ 1000 vòng/ phút trong 5 phút. Gạn bỏ lớp dịch nổi, hòa tan cặn tế bào với môi trường nuôi DMEM, rồi chuyển dung dịch tế bào sang chai nuôi cấy. Sau đó để chai nuôi trong tủ ấm với điều kiện 370C, 5% CO2.
Sau khi tế bào được đánh thức thành công, phát triển bình thường, không bị nhiễm khuẩn, nhân nuôi để đạt được lượng tế bào cần thiết 106- 107 tế bào/ml môi trường nuôi cấy. Trung bình sau 2 - 3 ngày môi trường phải được thay mới. Vì lúc này pH và chất dinh dưỡng cần cho sự phát triển tế bào đã thay đổi. Nếu môi trường không được thay đúng lúc, tế bào sẽ chết. Để thay môi trường trước hết cần ly tâm, hút bỏ môi trường cũ, tiếp đó đưa từ 5- 7 ml môi trường nuôi cấy phù hợp, để tủ ấm 37oC, 5% CO2 và tiếp tục nuôi.
- Bảo quản tế bào trong lạnh sâu
Chọn chai tế bào khỏe, tỷ lệ sống trên 95%, không bị nhiễm tạp khuẩn. Đổ bỏ môi trường cũ thay vào đó là môi trường mới, dùng pipet hút lên đẩy xuống cho tế bào rời đều trong môi trường. Hút dung dịch tế bào sang ống li tâm, li tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ dịch nổi, hòa cặn tế bào với môi trường 10% FBS, cho dung dịch này vào trong ống cất. Tiến hành
làm lạnh từ từ cho tới khi đạt được âm 25oC thì đưa nhanh ống cất vào lạnh âm 70oC, sau 20 giờ chuyển vào bình Nitơ lỏng.
- Dung hợp tế bào tế bào lympho B với myeloma Sp2/0
Hỗn dịch tế bào lympho B (nồng độ 108/ml) được đưa vào cùng với tế bào myeloma Sp2/0. Sau đó thêm vào 1ml PEG khuấy kĩ trong 1 phút, 5 phút sau thêm vào 3,5 ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT và ủ qua đêm ở 370C, 5%CO2, li tâm hỗn dịch tế bào, hòa cặn vào 30ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT và phân phối vào các giếng của đĩa loại 96 giếng và ủ trong tủ ấm 370C. Sau dung hợp từ 5 – 7 ngày thêm vào mỗi giếng 0,1 ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT. Sau 10 ngày dung hợp lấy dịch nổi và dùng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể mong muốn.
Chọn tế bào từ các giếng có hiệu giá kháng thể cao để tách dòng.
3.4.4. Sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng bằng phương pháp ELISA pháp ELISA
Pha loãng kháng nguyên Progesterone tới nồng độ 2µg/ml trong dung dịch Bicarbonate và BSA đạt nồng độ 2µg/ml trong PBS 1x. Vortex mạnh để có dung dịch đồng nhất. Dùng pipet đa kênh cho 100 µl kháng nguyên Progesterone và BSA đã pha loãng vào mỗi giếng của đĩa ELISA như sau:
Ủ qua đêm ở 4oC hoặc 2h ở 37oC. Pha dung dịch rửa PBS có bổ sung 0.5% Tween 20. Sau khi ủ, lấy đĩa ra khỏi tủ và loại bỏ kháng nguyên trong đĩa bằng cách vẩy mạnh và úp ngược đĩa trong vài phút. Dùng pipet cho vào mỗi giếng 200µl dung dịch rửa, lắc nhẹ đĩa vài lần. Sau đó loại bỏ dung dịch rửa và úp ngược đĩa, gõ nhẹ vài lần lên giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa. Lặp lại bước rửa này 3 lần.
Pha BSA trong PBS 1x để đạt nồng độ 5% (w/v). Cho vào mỗi giếng 100µl BSA đã pha loãng, lắc nhẹ đĩa cho dung dịch giàn đều. Sau đó ủ ở 37oC trong 1h. Sau khi ủ xong, rửa các giếng 3 - 4 lần như trên. Dùng pipet hút 100µl dịch tế bào từ các giếng có tế bào lai trong đĩa nuôi cấy tế bào sang các giếng của đĩa ELISA. Sau đó ủ trong tủ 37oC trong 1h.
Cần chú ý bổ sung môi trường vào các giếng đã hút dịch kháng thể đơn dòng ra, nếu không có đủ môi trường nuôi, các tế bào trong đĩa có thể chết rất nhanh.
Sau khi ủ, rửa các giếng 3 lần bằng PBS có bổ sung 0.5% Tween 20. Dùng dung dịch BSA 5%, pha loãng HRP IgG Antimouse với tỉ lệ 1/2500. Sau đó cho vào mỗi giếng của đĩa ELISA 100µl. Ủ đĩa ở 37oC trong 1h. Lặp lại bước rửa
như trên 3 - 4 lần. Cho vào mỗi giếng 100µl TMB, lắc nhẹ để dịch giàn đều trên mặt đĩa. Ủ ở nhiệt độ thường, tránh ánh sáng trong 15 phút. Sau 15 phút, bổ sung vào mỗi giếng 100µl HCL 1M để làm dừng phản ứng. Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 630 nm.
3.4.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone progesterone
Tiến hành nuôi cấy 5 dòng tế bào lai (E4, E3, C6, H3, F10) tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone Antigen
Các dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các loại kháng nguyên Progesterone Antigen đã được nhân lên với số lượng lớn và bảo quản trong Nitơ lỏng. Các dòng tế bào lai này được phục hồi theo các bước như sau:
- Lấy ống chứa tế bào ra khỏi bình bảo quản, đặt trong bể ủ ấm 37-40oC; - Khi hỗn dịch trong ống tan hoàn toàn, chuyển toàn bộ dịch này vào ống ly tâm có chứa sẵn 5ml môi trường DMEM
- Ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút
- Loại bỏ dịch phía trên, trộn phần cặn tế bào thu được với 20ml môi trường DMEM có bổ sung 5% FBS
- Chuyển môi trường vừa hòa cặn tế bào vào chai nuôi cấy. Nuôi cấy trong điều kiện 37oC có bổ sung 5%CO2
- Kiểm tra tế bào bằng kính hiển vi hàng ngày, tế bào được thu và nuôi cấy tiếp khi mật độ tế bào phủ 80% - 90% bề mặt chai nuôi cấy. Phương pháp thu tế bào từ chai nuôi cấy như sau:
+ Dùng pipet trộn đều để tế bào bong ra khỏi bề mặt đáy chai nuôi cấy; + Chuyển dịch sang ống ly tâm và ly tâm ở tốc dộ 1.500 vòng/phút trong 5 phút; + Hoàn nguyên cặn tế bào trong môi trường để nuôi cấy tiếp hoặc cất giữ bảo quản tế bào trong bình Nitơ
3.4.6. Phương pháp xác định nồng độ kháng thể đơn dòng được tạo ra trong dịch báng của chuột BALB/c dịch báng của chuột BALB/c
- Tiêm tế bào lai vào xoang phúc mạc của chuột
Chuột BALB/c (4 - 6 tuần tuổi) khỏe mạnh được tiêm 0.5ml pristine (2,6,10,14-tetramethyldecanoic acid) hoặc dung dịch FAI vào xoang phúc mạc chuột. Sau 7 ngày, tiến hành tiêm 0,5ml/con dung dịch tế bào lai có nồng độ 108
tế bào/ml vào xoang phúc mạc chuột. Sau đó, tiếp tục theo dõi chuột trong 7-10 ngày sau khi tiêm.
Hình 3.5. Chuột BALB/c trước khi tiêm
Hình 3.6. Tiêm tế bào lai vào xoang phúc mạc chuột
Tiến hành đếm số lượng tế bào và kiểm tra hình dạng tế bào. Đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer:
+ Trộn 100 µl hỗn dịch tế bào và 900 µl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha 1/10)
+ Đưa hỗn hợp thuốc nhuộm và tế bào này lên buồng đếm. Số tế bào trong/ml: C =
Trong đó: C: số tế bào trong 1 ml n: số tế bào trong 4 ô vuông d: nồng độ pha loãng
- Thu nhận dịch báng chứa kháng thể đơn dòng trong xoang phúc mạc chuột
Sau 3-5 ngày tiêm tế bào lai vào xoang phúc mạc của chuột, có thể quan sát thấy bụng phình to.Quan sát theo dõi chuột thí nghiệm sau 7-10 ngày có thể tiến hành thu dịch từ xoang phúc mạc.
Hình 3.7. Thu dịch báng trong xoang phúc mạc chuột
Hình 3.8. Dịch báng thu được sau khi ly tâm loại bỏ cặn
Chuột thu dịch báng được gây mê bằng Chloroform 10%. Cố định chuột trên giá xốp và khử trùng bằng Ethanol 70%.
Bộc lộ xoang phúc mạc của chuột bằng cách cắt lớp da từ xương ức đến phúc mạc chuột;
Dùng xi lanh 10ml gắn kim tiêm G16 (G18) để hút dịch;
Chuyển dịch sang các ống và ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ cặn
Chia nhỏ dịch thu được vào các ống 2ml và bảo quản ở -30oC
- Xác định hiệu giá kháng thể của dịch thu được bằng phương pháp ELISA
Tiến hành pha loãng dịch báng chuột theo các độ pha loãng khác nhau là 1, 1/50, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/700, 1/800. Sau đó tiến hành thực hiện phản ứng như sau:
+ Pha loãng kháng nguyên Progesterone Antigen tới nồng độ 2µg/ml trong dung dịch Bicarbonate;
+ Vortex mạnh để có được dung dịch đồng nhất;
+ Dùng pipet đa kênh cho 100µl kháng nguyên đã pha loãng vào mỗi giếng của đĩa ELISA;
+ Ủ qua đêm ở 4oC hoặc 2 giờ ở 37oC;
+ Pha dung dịch rửa PBS có bổ sung 0,5% Tween 20;
+ Sau khi ủ, lấy đĩa ra khỏi tủ và loại bỏ kháng nguyên trong đĩa bằng cách vẩy mạnh và úp ngược đĩa trong vài phút;
+ Dùng pipet cho vào mỗi giếng 200µl dung dịch rửa, lắc nhẹ đĩa vài lần. Sau đó loại bỏ dung dịch rửa và úp ngược đĩa, gõ nhẹ vài lần lên giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa;
+ Lặp lại bước rửa này 3 lần;
+ Pha BSA trong PBS 1x để đạt nồng độ 5%;
+ Cho vào mỗi giếng 100µl BSA đã pha loãng, lắc nhẹ đĩa cho dung dịch giàn đều. Sau đó ủ ở 37oC trong 1giờ;
+ Sau khi ủ xong, rửa các giếng 3 - 4 lần như trên;
+ Cho vào mỗi giếng của đĩa ELISA 100µl dịch báng đã pha loãng như trên. Ủ ở 37oC trong 1giờ;
+ Sau khi ủ, rửa các giếng 3 lần bằng PBS có bổ sung 0.5% Tween 20; + Dùng dung dịch BSA 5%, pha loãng HRPG Antimouse với tỉ lệ 1/2500. Sau đó cho vào mỗi giếng của đĩa ELISA 100µl. Ủ đĩa ở 37oC trong 1giờ;
+ Lặp lại bước rửa như trên 3-4 lần;
+ Cho vào mỗi giếng 100µl TMB, lắc nhẹ để dịch dàn đều trên mặt đĩa. Ủ ở nhiệt độ thường, tránh ánh sáng trong 15 phút;
+ Sau 15 phút, bổ sung vào mỗi giếng 100µl HCL 1M để làm dừng phản ứng; + Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 280nm.
- Tinh chế kháng thể từ dịch nước báng
+ Kháng thể đơn dòng từ dịch nước báng được tinh chế bằng cột tinh chế IgG HiTrap protein G HP của Amersham Biociences.
+ Tiến hành đo mật độ quang OD450nm dùng để xác định hàm lượng protein tổng số của dịch báng sau tinh chế.
- Chạy điện di kháng thể IgG thu được trên gel SDS-PAGE
+ Bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE xác định độ tinh sạch của kháng thể sau khi tinh chế.
3.4.7. Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa kháng thể đơn dòng với các kháng nguyên dòng với các kháng nguyên
- Bằng phương pháp ELISA kiểm tra bắt cặp đặc hiệu của kháng thể đơn dòng được tạo ra với kháng nguyên tương ứng.
- Bằng phương pháp ELISA kiểm tra bắt cặp chéo giữa các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các kháng nguyên khác nhau.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Quy trình chọn lọc và tạo các dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng có chất lượng cao kháng progesterone là một quy trình hết sức phức tạp, gồm nhiều giai đoạn. Do đó cần hoàn thiện phương pháp cho từng giai đoạn, trước hết cần xác định lượng kháng nguyên thích hợp với chuột thí nghiệm để đáp ứng miễn dịch tối ưu nhằm thu được tế bào sinh kháng thể tốt. Tế bào Lympho B mẫn cảm kháng nguyên thu từ lách và hạch bẹn của chuột được dung hợp với tế bào Myeloma Sp2/0 để tạo dòng tế bào lai có khả năng tiết kháng thể đơn dòng. Bằng phản ứng ELISA đã sàng lọc được dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với Progesterone. Kết quả thu được từ nghiên cứu này cho thấy kháng nguyên Progesterone có khả năng gây đáp ứng miễn dịch ở chuột BALB/c tạo kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên Progesterone. Từ phản ứng ELISA cho thấy các dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone.