Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.3. Phương pháp đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0 dùng để dung
- Đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0
Chuyển ống tế bào Myeloma Sp2/0 từ Nitơ lỏng sang bể ủ ấm 370C cho rã đơng, khử trùng phía ngồi bằng cồn 700C. Dung dịch tế bào được chuyển sang ống ly tâm, tiến hành ly tâm với tốc độ 1000 vòng/ phút trong 5 phút. Gạn bỏ lớp dịch nổi, hòa tan cặn tế bào với môi trường nuôi DMEM, rồi chuyển dung dịch tế bào sang chai ni cấy. Sau đó để chai ni trong tủ ấm với điều kiện 370C, 5% CO2.
Sau khi tế bào được đánh thức thành công, phát triển bình thường, khơng bị nhiễm khuẩn, nhân nuôi để đạt được lượng tế bào cần thiết 106- 107 tế bào/ml môi trường nuôi cấy. Trung bình sau 2 - 3 ngày môi trường phải được thay mới. Vì lúc này pH và chất dinh dưỡng cần cho sự phát triển tế bào đã thay đổi. Nếu môi trường không được thay đúng lúc, tế bào sẽ chết. Để thay môi trường trước hết cần ly tâm, hút bỏ mơi trường cũ, tiếp đó đưa từ 5- 7 ml môi trường nuôi cấy phù hợp, để tủ ấm 37oC, 5% CO2 và tiếp tục nuôi.
- Bảo quản tế bào trong lạnh sâu
Chọn chai tế bào khỏe, tỷ lệ sống trên 95%, không bị nhiễm tạp khuẩn. Đổ bỏ môi trường cũ thay vào đó là mơi trường mới, dùng pipet hút lên đẩy xuống cho tế bào rời đều trong môi trường. Hút dung dịch tế bào sang ống li tâm, li tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ dịch nổi, hòa cặn tế bào với môi trường 10% FBS, cho dung dịch này vào trong ống cất. Tiến hành
làm lạnh từ từ cho tới khi đạt được âm 25oC thì đưa nhanh ống cất vào lạnh âm 70oC, sau 20 giờ chuyển vào bình Nitơ lỏng.
- Dung hợp tế bào tế bào lympho B với myeloma Sp2/0
Hỗn dịch tế bào lympho B (nồng độ 108/ml) được đưa vào cùng với tế bào myeloma Sp2/0. Sau đó thêm vào 1ml PEG khuấy kĩ trong 1 phút, 5 phút sau thêm vào 3,5 ml mơi trường huyết thanh có bổ sung HAT và ủ qua đêm ở 370C, 5%CO2, li tâm hỗn dịch tế bào, hịa cặn vào 30ml mơi trường huyết thanh có bổ sung HAT và phân phối vào các giếng của đĩa loại 96 giếng và ủ trong tủ ấm 370C. Sau dung hợp từ 5 – 7 ngày thêm vào mỗi giếng 0,1 ml mơi trường huyết thanh có bổ sung HAT. Sau 10 ngày dung hợp lấy dịch nổi và dùng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể mong muốn.
Chọn tế bào từ các giếng có hiệu giá kháng thể cao để tách dịng.