Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.4. Sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng bằng phương pháp
pháp ELISA
Pha lỗng kháng ngun Progesterone tới nồng độ 2µg/ml trong dung dịch Bicarbonate và BSA đạt nồng độ 2µg/ml trong PBS 1x. Vortex mạnh để có dung dịch đồng nhất. Dùng pipet đa kênh cho 100 µl kháng nguyên Progesterone và BSA đã pha loãng vào mỗi giếng của đĩa ELISA như sau:
Ủ qua đêm ở 4oC hoặc 2h ở 37oC. Pha dung dịch rửa PBS có bổ sung 0.5% Tween 20. Sau khi ủ, lấy đĩa ra khỏi tủ và loại bỏ kháng nguyên trong đĩa bằng cách vẩy mạnh và úp ngược đĩa trong vài phút. Dùng pipet cho vào mỗi giếng 200µl dung dịch rửa, lắc nhẹ đĩa vài lần. Sau đó loại bỏ dung dịch rửa và úp ngược đĩa, gõ nhẹ vài lần lên giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa. Lặp lại bước rửa này 3 lần.
Pha BSA trong PBS 1x để đạt nồng độ 5% (w/v). Cho vào mỗi giếng 100µl BSA đã pha loãng, lắc nhẹ đĩa cho dung dịch giàn đều. Sau đó ủ ở 37oC trong 1h. Sau khi ủ xong, rửa các giếng 3 - 4 lần như trên. Dùng pipet hút 100µl dịch tế bào từ các giếng có tế bào lai trong đĩa ni cấy tế bào sang các giếng của đĩa ELISA. Sau đó ủ trong tủ 37oC trong 1h.
Cần chú ý bổ sung môi trường vào các giếng đã hút dịch kháng thể đơn dịng ra, nếu khơng có đủ mơi trường ni, các tế bào trong đĩa có thể chết rất nhanh.
Sau khi ủ, rửa các giếng 3 lần bằng PBS có bổ sung 0.5% Tween 20. Dùng dung dịch BSA 5%, pha loãng HRP IgG Antimouse với tỉ lệ 1/2500. Sau đó cho vào mỗi giếng của đĩa ELISA 100µl. Ủ đĩa ở 37oC trong 1h. Lặp lại bước rửa
như trên 3 - 4 lần. Cho vào mỗi giếng 100µl TMB, lắc nhẹ để dịch giàn đều trên mặt đĩa. Ủ ở nhiệt độ thường, tránh ánh sáng trong 15 phút. Sau 15 phút, bổ sung vào mỗi giếng 100µl HCL 1M để làm dừng phản ứng. Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 630 nm.