Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.6. Phương pháp xác định nồng độ kháng thể đơn dòng được tạo ra trong
dịch báng của chuột BALB/c
- Tiêm tế bào lai vào xoang phúc mạc của chuột
Chuột BALB/c (4 - 6 tuần tuổi) khỏe mạnh được tiêm 0.5ml pristine (2,6,10,14-tetramethyldecanoic acid) hoặc dung dịch FAI vào xoang phúc mạc chuột. Sau 7 ngày, tiến hành tiêm 0,5ml/con dung dịch tế bào lai có nồng độ 108
tế bào/ml vào xoang phúc mạc chuột. Sau đó, tiếp tục theo dõi chuột trong 7-10 ngày sau khi tiêm.
Hình 3.5. Chuột BALB/c trước khi tiêm trước khi tiêm
Hình 3.6. Tiêm tế bào lai vào xoang phúc mạc chuột phúc mạc chuột
Tiến hành đếm số lượng tế bào và kiểm tra hình dạng tế bào. Đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer:
+ Trộn 100 µl hỗn dịch tế bào và 900 µl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha 1/10)
+ Đưa hỗn hợp thuốc nhuộm và tế bào này lên buồng đếm. Số tế bào trong/ml: C =
Trong đó: C: số tế bào trong 1 ml n: số tế bào trong 4 ơ vng d: nồng độ pha lỗng
- Thu nhận dịch báng chứa kháng thể đơn dòng trong xoang phúc mạc chuột
Sau 3-5 ngày tiêm tế bào lai vào xoang phúc mạc của chuột, có thể quan sát thấy bụng phình to. Quan sát theo dõi chuột thí nghiệm sau 7-10 ngày có thể tiến hành thu dịch từ xoang phúc mạc.
Hình 3.7. Thu dịch báng trong xoang phúc mạc chuột phúc mạc chuột
Hình 3.8. Dịch báng thu được sau khi ly tâm loại bỏ cặn sau khi ly tâm loại bỏ cặn
Chuột thu dịch báng được gây mê bằng Chloroform 10%. Cố định chuột trên giá xốp và khử trùng bằng Ethanol 70%.
Bộc lộ xoang phúc mạc của chuột bằng cách cắt lớp da từ xương ức đến phúc mạc chuột;
Dùng xi lanh 10ml gắn kim tiêm G16 (G18) để hút dịch;
Chuyển dịch sang các ống và ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ cặn
Chia nhỏ dịch thu được vào các ống 2ml và bảo quản ở -30oC
- Xác định hiệu giá kháng thể của dịch thu được bằng phương pháp ELISA
Tiến hành pha loãng dịch báng chuột theo các độ pha loãng khác nhau là 1, 1/50, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/700, 1/800. Sau đó tiến hành thực hiện phản ứng như sau:
+ Pha loãng kháng nguyên Progesterone Antigen tới nồng độ 2µg/ml trong dung dịch Bicarbonate;
+ Vortex mạnh để có được dung dịch đồng nhất;
+ Dùng pipet đa kênh cho 100µl kháng nguyên đã pha loãng vào mỗi giếng của đĩa ELISA;
+ Ủ qua đêm ở 4oC hoặc 2 giờ ở 37oC;
+ Pha dung dịch rửa PBS có bổ sung 0,5% Tween 20;
+ Sau khi ủ, lấy đĩa ra khỏi tủ và loại bỏ kháng nguyên trong đĩa bằng cách vẩy mạnh và úp ngược đĩa trong vài phút;
+ Dùng pipet cho vào mỗi giếng 200µl dung dịch rửa, lắc nhẹ đĩa vài lần. Sau đó loại bỏ dung dịch rửa và úp ngược đĩa, gõ nhẹ vài lần lên giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa;
+ Lặp lại bước rửa này 3 lần;
+ Pha BSA trong PBS 1x để đạt nồng độ 5%;
+ Cho vào mỗi giếng 100µl BSA đã pha lỗng, lắc nhẹ đĩa cho dung dịch giàn đều. Sau đó ủ ở 37oC trong 1giờ;
+ Sau khi ủ xong, rửa các giếng 3 - 4 lần như trên;
+ Cho vào mỗi giếng của đĩa ELISA 100µl dịch báng đã pha lỗng như trên. Ủ ở 37oC trong 1giờ;
+ Sau khi ủ, rửa các giếng 3 lần bằng PBS có bổ sung 0.5% Tween 20; + Dùng dung dịch BSA 5%, pha loãng HRPG Antimouse với tỉ lệ 1/2500. Sau đó cho vào mỗi giếng của đĩa ELISA 100µl. Ủ đĩa ở 37oC trong 1giờ;
+ Lặp lại bước rửa như trên 3-4 lần;
+ Cho vào mỗi giếng 100µl TMB, lắc nhẹ để dịch dàn đều trên mặt đĩa. Ủ ở nhiệt độ thường, tránh ánh sáng trong 15 phút;
+ Sau 15 phút, bổ sung vào mỗi giếng 100µl HCL 1M để làm dừng phản ứng; + Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 280nm.
- Tinh chế kháng thể từ dịch nước báng
+ Kháng thể đơn dòng từ dịch nước báng được tinh chế bằng cột tinh chế IgG HiTrap protein G HP của Amersham Biociences.
+ Tiến hành đo mật độ quang OD450nm dùng để xác định hàm lượng protein tổng số của dịch báng sau tinh chế.
- Chạy điện di kháng thể IgG thu được trên gel SDS-PAGE
+ Bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE xác định độ tinh sạch của kháng thể sau khi tinh chế.
3.4.7. Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa kháng thể đơn dòng với các kháng nguyên dòng với các kháng nguyên
- Bằng phương pháp ELISA kiểm tra bắt cặp đặc hiệu của kháng thể đơn dòng được tạo ra với kháng nguyên tương ứng.
- Bằng phương pháp ELISA kiểm tra bắt cặp chéo giữa các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các kháng nguyên khác nhau.