Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.4. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng bằng phản ứng
BẰNG PHẢN ỨNG ELISA
Để sàng lọc được tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng kháng progesterone, dịch nuôi cấy tế bào của tất cả các giếng có tế bào lai đã được thu nhận và đánh giá bằng phản ứng ELISA.
Sau khi kiểm tra khả năng tạo kháng thể bằng phương pháp ELISA, ta biết được giếng nào có kháng thể, tuy nhiên đây là kháng thể đa dòng do nhiều dịng tế bào lai tạo thành. Để có kháng thể đơn dòng ta phải tiến hành sàng lọc được các tế bào dương tính, những giếng có hiệu giá kháng thể cao sẽ cho giá trị cao. Từ kết quả này chúng tơi đã chọn một số giếng có hiệu giá cao nhất để đánh giá tiếp.
Sau khi sàng lọc lần đầu khoảng 24h, tiến hành sàng lọc kháng thể đơn dòng với BSA bằng phương pháp ELISA. Ở lần sàng lọc này chỉ chọn những
giếng có tế bào lai và có kết quả tốt ở lần 1. Tuy nhiên khi bố trí thí nghiệm sẽ gắn song song giữa kháng nguyên Progesterone và kháng nguyên BSA.
Do hormone Progesterone là phi protein nên để tăng khả năng đáp ứng miễn dịch thì Progesterone đã được gắn với BSA, do đó chuột đáp ứng miễn dịch với cả progesterone và với BSA. Vì vậy, để sàng lọc và thu nhận đúng được các dòng tế bào lai hydridoma tiết kháng thể cho từng loại kháng nguyên thì các kháng nguyên khác nhau sẽ được gắn bản riêng rẽ cho tế bào lai tương ứng trong phản ứng ELISA. Bên cạnh đó, mỗi phản ứng ELISA với kháng nguyên gắn bản là BSA được thực hiện song song.
Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng cho từng loại kháng nguyên khác nhau được thể hiện trong Bảng 4.4, Bảng 4.5 và Bảng 4.6.
Bảng 4.4. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesteron Antigen bằng phản ứng ELISA
Lần lai Tổng số giếng kiểm tra Kết quả phản ứng ELISA Sử dụng kháng nguyên gắn bản Pro-Antigen Sử dụng kháng nguyên gắn bản BSA Số giếng cho kết quả dương tính với
kháng nguyên Pro-Antigen âm tính với BSA Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) 1 654 14 2,14 14 2,14 0 0 2 701 18 2,57 15 2,14 3 0,43 3 629 26 4,13 26 4,13 0 0 4 723 25 3,46 23 3,18 2 0,28 5 743 14 1,88 14 1,88 0 0
Kết quả thể hiện ở Bảng 4.4 cho thấy:
Ở lần lai thứ nhất có 14/654 giếng (2,14%), lần lai thứ ba có 26/629 giếng (4,13%) và lần lai thứ năm có 14/743 giếng(1,88%) đều cho kết quả ELISA dương tính khi sử dụng hai loại kháng nguyên gắn bản riêng rẽ là Progesterone-Antigen và BSA.
Đối với lần lai thứ hai có 18/701 giếng (2,57%) cho kết quả ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone Antigen, trong khi chỉ có 15/701 giếng
(2,14%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên gắn bản BSA. Điều này cũng có nghĩa là trong số 18 giếng cho kết quả ELISA dương tính với Progesterone Antigen thì có đến 15/18 giếng (83,33%) có kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên là BSA và chỉ có 3/18 giếng (16,67%) có kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên là Progesterone Antigen mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA
Đối với lần lai thứ tư có 25/723 giếng (3,46%) cho kết quả ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone Antigen, trong khi chỉ có 23/723 giếng (3,18%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên gắn bản BSA. Điều này cũng có nghĩa là trong số 25 giếng cho kết quả ELISA dương tính với Progesterone Antigen thì có đến 23/25 giếng (92%) có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên là BSA và chỉ có 2/25 giếng (8%) có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên là Progesterone Antigen mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA.
Như vậy sau 5 lần lai chúng tôi đã lai tạo thành công 5 dòng tế bào lai (đặt tên là: E4, E3, C6, H3, F10) tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên progesterone Antigen. Từ các dòng tế bào này, chúng tôi tiến hành nhân giống với số lượng lớn để bảo quản và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 4.5. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen bằng phản ứng ELISA
Lần lai Tổng số giếng kiểm tra Kết quả phản ứng ELISA Sử dụng kháng nguyên gắn bản Pro-3-BSA Sử dụng kháng nguyên gắn bản BSA Số giếng cho kết quả dương tính với kháng nguyên Pro-3-BSA, âm tính với BSA Số giếng
dương tính Tỷ lệ (%) Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) dương tính Số giếng Tỷ lệ (%) 1 378 0 0 0 0 0 0 2 589 19 3,23 19 3,23 0 0 3 478 9 1,88 7 1,46 2 0,42 4 602 12 1,99 12 1,99 0 0 5 721 21 2,91 20 2,77 1 0,14 Kết quả thể hiện ở Bảng 4.5 cho thấy:
sử dụng hai loại kháng nguyên gắn bản riêng rẽ là Progesterone-3-BSA và BSA Ở lần lai thứ hai có 19/589 giếng (3,23%), lần lai thứ tư có 12/602 giếng (1,99%) đều cho kết quả ELISA dương tính khi sử dụng hai loại kháng nguyên gắn bản riêng rẽ là Progesterone-3-BSA và BSA.
Đối với lần lai thứ ba có 9/478 giếng (1,88%) cho kết quả ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen, trong khi chỉ có 7/478 giếng (1,46%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên gắn bản BSA. Điều này cũng có nghĩa là trong số 9 giếng cho kết quả ELISA dương tính với kháng ngun Progesterone-3-BSA Antigen thì có đến 7/9 giếng (77,78%) có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên là BSA và chỉ có 2/9 giếng (22,22%) có kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên là Progesterone-3-BSA Antigen mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA.
Đối với lần lai thứ năm có 21/721 giếng (2,91%) cho kết quả ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen, trong khi chỉ có 20/721 giếng (2,77%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên gắn bản BSA. Điều này cũng có nghĩa là trong số 21 giếng cho kết quả ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen thì có đến 20/21 giếng (95,24%) có kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên là BSA và chỉ có 1/21 giếng (4,76%) có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên là Progesterone -3- BSA Antigen mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA.
Như vậy sau 5 lần lai chúng tôi đã lai tạo thành cơng 3 dịng tế bào lai (đặt tên là: C12, D7, F11) tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-BSA antigen. Từ các dòng tế bào này, chúng tôi tiến hành nhân giống với số lượng lớn để bảo quản và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Kết quả Bảng 4.6 cho thấy:
Ở lần lai thứ nhất có 7/576 giếng (1,22%), lần lai thứ hai có 16/689 giếng (2,23%), lần lai thứ 4 có 29/664 giếng (4,37%), lần lai thứ 5 có 11/593 giếng (1,85%) đều cho kết quả ELISA dương tính khi sử dụng hai loại kháng nguyên gắn bản riêng rẽ là Progesterone-3-CMO:BSA Antigen và BSA.
Đối với lần lai thứ ba có 13/704 giếng (1,85%) cho kết quả ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone-3-CMO:BSA Antigen, trong khi chỉ có 10/704 giếng (1,42%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên gắn bản BSA. Điều này cũng có nghĩa là trong số 13 giếng cho kết quả ELISA dương tính với kháng ngun
Progesterone-3-CMO:BSA Antigen thì có đến 10/13 giếng (76,92%) có kháng thể đơn dịng đặc hiệu cho kháng nguyên là BSA và chỉ có 3/13 giếng (23,08%) có kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên là Progesterone-3-CMO: BSA Antigen mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA.
Như vậy sau 5 lần lai chúng tơi đã lai tạo thành cơng 3 dịng tế bào lai (đặt tên là: G5, H3, A7) tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-CMO:BSA Antigen. Từ các dịng tế bào này, chúng tơi tiến hành nhân giống với số lượng lớn để bảo quản và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Nhận xét chung: Thông qua kết quả Bảng 4.4, Bảng 4.5, Bảng 4.6 cho thấy, tỷ lệ giếng tế bào lai có kết quả dương tính với các loại kháng nguyên thấp (dưới 5%).
Ở các lần lai, tỷ lệ số giếng dương tính với kháng nguyên progesterone Antigen dao động từ 1,88% - 4,13%, với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen dao động từ 0% - 3.23%, với kháng nguyên Progesterone-3-CMO: BSA Antigen dao động từ 1,22% - 4,37% trên tổng số giếng có tế bào lai.
Bảng 4.6. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone -3- CMO:BSA Antigen bằng phản ứng ELISA
Lần lai Tổng số giếng kiểm tra Kết quả phản ứng ELISA Sử dụng kháng nguyên gắn bản Pro-3-CMO Sử dụng kháng nguyên gắn bản BSA Số giếng cho kết quả dương tính với
kháng nguyên Pro-3-CMO, âm tính với BSA Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) Số giếng dương tính Tỷ lệ (%) 1 576 7 1,22 7 1,22 0 0 2 689 16 2,32 16 2,32 0 0 3 704 13 1,85 10 1,42 3 0,43 4 664 29 4,37 29 4,37 0 0 5 593 11 1,85 11 1,85 0 0
Tuy nhiên, khi sử dụng kháng nguyên gắn bản là BSA cho phản ứng ELISA để kiểm tra tính đặc hiệu của các tế bào lai đối với các loại kháng nguyên thì tỷ lệ số giếng có tế bào lai dương tính với các loại kháng nguyên và âm tính với BSA là rất thấp (<1% so với tổng số giếng có tế bào lai).
Số giếng có tế bào lai ở các lần lai khác nhau có khả năng tiết kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên progesterone Antigen là 5/3450 tổng số giếng, với kháng
nguyên Progesterone -3- BSA Antigen là 3/2768 tổng số giếng, với kháng nguyên Progesterone-3-CMO:BSA Antigen có 3/3226 tổng số giếng.
Như vậy, ở các lần lai khác nhau thì tỷ lệ giếng có tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng đặc hiệu với kháng nguyên thấp hơn so với nghiên cứu của Cù Thị Thiên Thu và cs.(2017), White et al (1982), Yücel and Çirakoğlu (1999). Tỷ lệ số giếng có tế bào tiết kháng thể đơn dịng đặc hiệu với kháng nguyên là progesterone trong nghiên cứu của Cù Thị Thiên Thu và cs.(2017) là 0,68%, của White et al (1982) ở 2 lần lai là 16,67% (4/24 giếng) và 41,67% (10/24 giếng). Theo nghiên cứu của cel & Çirakoğlu (1999), số giếng có tế bào tiết kháng thể trong 2 lần lai lần lượt là 3,7% (có 5/135 giếng) và 4,58% (có 11/240 giếng), tuy nhiên số giếng có tế bào lai tiết kháng thể đặc hiệu với progesterone chỉ có 1 giếng/1 lần lai. Trong nghiên cứu tương tự của cel & Çirakoğlu (2000 ) thì số giếng có tế bào lai tiết kháng thể ở 2 lần lai lần lượt là 5,3% (21/396 giếng), 3,2% (8/249 giếng) và ở mỗi lần lai cũng chỉ có 1 giếng tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với progesterone.