Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.5. Kết quả nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng
`Để đánh giá khả năng phát triển ổn định, khả năng tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu với Progesterone Antigen của các dòng tế bào lai đã được tạo ra (E4, E3, C6, H3, F10) sau khi phục hồi các dịng tế bào lai được ni cấy trong mơi trường nuôi cấy tế bào DMEM bổ sung 10% FBS được nuôi ở 37°C, 5% CO2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tế bào lai phát triển tốt, khơng có hiện tượng tạp nhiễm các vi khuẩn hay nấm mốc. Hình dạng tế bào trịn đều, khơng có tế bào dị dạng. Sau 72 giờ phục hồi, lượng tế bào đạt 85-90% bề mặt chai ni cấy (Hình 4.1, Hình 4.2).
Hình 4.1. Tế bào lai sau 24h phục hồi dưới kính hiển vi độ phóng đại 10x20 dưới kính hiển vi độ phóng đại 10x20
Hình 4.2. Tế bào lai sau 72h phục hồi dưới kính hiển vi độ phóng đại 10x20 dưới kính hiển vi độ phóng đại 10x20
Kết quả đếm tế bào của 5 dòng tế bào lai (E3, E4,C6,H3,F10) cho thấy, số lượng tế bào đạt trong khoảng 7,96x106- 8,98x106 tế bào trong 0,5ml dịch sau khi
được phục hồi. Số lượng tế bào đều gia tăng sau 3 ngày ni cấy (P<0,0001). Bên cạnh đó, số lượng tế bào sau khi phục hồi khơng có sự khác biệt giữa các dòng tế bào lai (P>0,0001) (Bảng 4.7).
Bảng 4.7. Số lượng tế bào sau khi phục hồi
Dòng tế bào lai Ngày phục hồi
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
E3 2,36x104 11,32x105 8,95x106 E4 2,17x104 8,30x105 8,59x106 C6 2,20x104 9,33x105 8,98x106 H3 2,12x104 9,30x105 7,96x106 F10 2,13x104 10,28x105 8,29x106
4.6. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐƯỢC TẠO RA TRONG DỊCH BÁNG CỦA CHUỘT BALB/c TRONG DỊCH BÁNG CỦA CHUỘT BALB/c
Toàn bộ kháng thể từ dịch nuôi cấy tế bào và dịch báng chuột từ mỗi dòng kháng thể được tinh sạch, sau đó được pha lỗng ở các nồng độ khác nhau để thực hiện phản ứng ELISA.
4.6.1. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ELISA
Từ các mẫu dịch nước báng thu được, tiến hành pha loãng theo các dải nồng độ 1, 1/50, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/700, 1/800. Dịch nước báng ở độ pha loãng tới 1/200 cho hiệu giá kháng thể ở mức cao. Từ độ pha loãng 1/300 lần bắt đầu giảm mạnh và ở độ pha lỗng 1/800 thì hàm lượng kháng thể ở mức rất thấp (Hình 4.3).
4.6.2. Kết quả tinh chế kháng thể từ dịch nước báng
Kháng thể đơn dòng từ dịch nước báng được tinh chế bằng cột tinh chế IgG HiTrap protein GHP của Amersham Biociences. Các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với progesterone đều thuộc kháng thể IgG, điều này phù hợp với nghiên cứu của Yücel and Çirakoğlu (1999, 2000).
Kết quả đo mật độ quang OD450nm dùng để xác định hàm lượng protein tổng số có trong mẫu dịch nước báng tinh chế. Các phân đoạn 3, 4, 5 và 6 cho kết quả OD450nm cao, các phân đoạn cịn lại có OD450nm thấp hơn (Hình 4.4).
Từ độ OD450nm thu được quy đổi ra hàm lượng IgG cho thấy, kháng thể tinh chế tập trung ở các phân đoạn 3, 4, 5 và 6 với nồng độ lần lượt là 2.106 mg/ml 2.228mg/ml, 1.705mg/ml và 1.216mg/ml. Trong đó, phân đoạn 4 thu được nhiều nhất với hàm lượng 5.615mg.
Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn các phân đoạn thu được khi tinh chế kháng thể đơn dòng từ dịch nước báng
Tổng lượng kháng thể đơn dòng IgG thu được là 20.63mg. Như vậy, với 10ml dịch nước báng thô, nồng độ IgG thu được là 2.063mg/ml (Bảng 4.8).
Bảng 4.8. Hàm lượng kháng thể đặc hiệu progesterone sau tinh chế
Phân đoạn OD450nm Nồng độ IgG (mg/ml) Hàm lượng IgG (mg)
1 0,034 0,025 0,063 2 0,297 0,22 0,554 3 2,843 2,106 5,307 4 3,008 2,228 5,615 5 2,302 1,705 4,297 6 1,642 1,216 3,065 7 0,504 0,373 0,941 8 0,235 0,174 0,439 9 0,162 0,120 0,302 10 0,024 0,018 0,045
4.6.3. Kết quả chạy điện di kháng thể IgG thu được trên gel SDS-PAGE
Kết quả tinh chế còn thể hiện ở độ tinh sạch của kháng thể sau tinh chế. Để kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể đơn dòng sau tinh chế được tiến hành kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE. Các mẫu 3,4,5 và 6 tương ứng với các phân đoạn 3, 4, 5 và 6 có hàm lượng IgG nhiều hơn các mẫu khác. Ở các mẫu còn lại hàm lượng kháng thể thấp hơn. Các mẫu tinh sạch đều cho băng điện di rõ ràng cho thấy kháng thể tinh chế được có độ sạch cao (Hình 4.5).
8 7 6 5 4 3 2 9
Hình 4.5. Dịch thu được ở các phân đoạn 2-9
4.7 KẾT QUẢ KIỂM TRA KHẲ NĂNG BẮT CẶP ĐẶC HIỆU, BẮT CẶP CHÉO GIỮA KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG VỚI CÁC KHÁNG NGUYÊN
- Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng thể đơn dòng được tạo ra với kháng nguyên tương ứng bằng phương pháp ELISA
Trong quá trình tạo các dịng tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng kháng Progesterone, chúng tơi thu được 11 dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng kháng Progesterone bao gồm: 5 dòng tế bào lai (E4, E3, C6, H3, F10) có khả năng tiết kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên Progesterone Antigen hãng MyBiosource, 3 dòng tế bào lai (C12, D7, F11) có khả năng tiết kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen hãng East Coat Bio và 3 dòng tế bào lai (G5, H3, A7) có khả năng tiết kháng thể đơn dịng kháng kháng nguyên Progesterone-3-CMO:Antigen hãng Novateteinbio, các dòng tế bào được kí hiệu theo thứ tự Pro-Mab1 đến Pro-Mab11.
Bảng 4.9. Tính đặc hiệu của các kháng thể đơn dịng tạo ra với các kháng nguyên tương ứng
Dòng tế bào
Progesterone
Antigen 3-BSA Antigen Progesterone-
Progesterone- 3-CMO:BSA Antigen Kháng nguyên BSA Kháng nguyên BSA Kháng nguyên BSA Progesterone Antigen Pro-Mab1 1,532 0,081 1,381 0,032 1,224 0,048 Pro-Mab2 1,597 0,072 1,497 0,074 1,324 0,083 Pro-Mab3 1,472 0,065 1,267 0,065 1,387 0,082 Pro-Mab4 1,310 0,071 1,275 0,085 1,198 0,075 Pro-Mab5 1,689 0,068 1,571 0,076 1,285 0,086 Progesterone -3-BSA Antigen Pro-Mab6 1,432 0,023 1,783 0,059 1,483 0,064 Pro-Mab7 1,372 0,034 1,863 0,063 1,284 0,062 Pro-Mab8 1,193 0,051 1,653 0,075 1,461 0,078 Progesterone- 3-CMO:BSA Antigen Pro-Mab9 1,275 0,042 1,398 0,058 1,732 0,068 Pro-Mab10 1,167 0,057 1,297 0,082 1,832 0,058 Pro-Mab11 1,201 0,082 1,173 0,091 1,522 0,093
Theo kết quả (bảng 4.9) cho thấy:
Các kháng thể đơn dòng được tạo ra kết hợp đặc hiệu với các kháng nguyên tương ứng, thể hiện ở chỗ giá trị OD kết hợp với kháng nguyên tương ứng thì cao nhất (cao hơn so với giá trị OD kết hợp với các kháng nguyên khác).
Kết luận: Tất cả các dòng tế bào lai đều tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các kháng nguyên tương ứng
- Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp chéo giữa các kháng thể đơn dòng
đặc hiệu với các kháng nguyên khác nhau bằng phương pháp ELISA
Tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng là khả năng kết hợp duy nhất kháng nguyên progesterone mà khơng bắt cặp chéo với các kháng ngun khác có cấu trúc tương tự, cùng nhóm steroid. Ngồi progesterone trong huyết thanh động vật cịn các hormone cùng nhóm steroid khác có cấu tạo hoá học gần giống với progesterone như Estradiol, Costirol, Aldosterone, Testosterone.
Để kiểm tra tính đặc hiệu của các dòng kháng thể đơn dịng với kháng ngun Progesterone, chúng tơi tiến hành đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các
dịng kháng thể với các kháng ngun có cấu trúc cùng nhóm Steroid với kháng nguyên Progesterone bao gồm: kháng nguyên Estradiol (E2)-6-BSA, kháng nguyên Costirol-3-BSA, kháng nguyên Aldosterone-BSA, kháng nguyên Testosterone-3-BSA. Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp chéo giữa các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các kháng nguyên khác bằng phản ứng ELISA (Bảng 4.10)
Bảng 4.10. Khả năng bắt cặp chéo giữa các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các kháng nguyên khác bằng phản ứng ELISA Dòng
kháng thể
Hiệu giá
Kháng nguyên
Pro Estradiol Costirol Aldosterone Testosterone
Pro-Mab1 1,621 + - - - - Pro-Mab2 1,543 + - - - - Pro-Mab3 1,559 + - - - - Pro-Mab4 1,397 + - - - - Pro-Mab5 1,582 + - - - - Pro-Mab6 1,843 + - - - - Pro-Mab7 1,731 + - - - - Pro-Mab8 1,643 + - - - - Pro-Mab9 1,753 + - - - - Pro-Mab10 1,597 + - - - - Pro-Mab11 1,728 + - - - -
Ghi chú: (+) Kết quả dương tính với giá trị OD ≥ 0,5 trong phản ứng ELISA ( - ) Kết quả âm tính với giá trị OD < 0,5 trong phản ứng ELISA
Dựa vào kết quả Bảng 4.10 cho thấy: Các dòng kháng thể đơn dịng có tính đặc hiệu cao kháng nguyên Progesterone (dương tính) trong phản ứng ELISA, hiệu giá của các kháng thể đơn dịng đều có giá trị cao với giá trị OD >1,3 và âm tính với tất cả các kháng ngun cịn lại.
Các dòng tế bào này tiếp tục được nhân nuôi thu dịch nổi, lưu giữ tế bào trong Nitơ lỏng và gây báng cho chuột nhằm thu lượng kháng thể cao trong các nghiên cứu tiếp theo.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
- Chuột có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt nhất đối với các kháng nguyên progesterone ở nồng độ 200 µg/lần/con.
- Kết quả nghiên cứu đã tạo được các dòng tế bào lai để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo, cụ thể:
+ Đã tạo được 5 dòng tế bào lai (đặt tên là: E4, E3, C6, H3, F10) có khả năng tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone Antigen
+ Đã tạo được 3 dòng tế bào lai (đặt tên là: C12, D7, F11) có khả năng tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen
+ Đã tạo được 3 dòng tế bào lai (đặt tên là: G5, H3, A7) có khả năng tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-CMO:BSA Antigen.
- Các kháng thể đơn dòng được tạo ra kết hợp đặc hiệu với các kháng nguyên tương ứng.
5.3. KIẾN NGHỊ
- Cần tiếp tục thử nghiệm các dòng kháng thể đơn dòng tạo ra để ứng dụng chế tạo thành công que thử nhanh (Quick Sticks) chẩn đốn có thai sớm ở bị và rối loạn hormone sinh sản cho vật nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu Tiếng Việt:
4. Cù Thị Thiên Thu, Nguyễn Bá Mùi, Lê Văn Phan, Nguyễn Thị Phương Giang, Nguyễn Hồng Thịnh, Phạm Kim Đăng (2017). Tạo dịng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng kháng Progesterone. Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam. 23(12) 12.2017.
5. Cục chăn nuôi (2019). Báo cáo kết quả thực hiện chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 và định hướng phát triển chăn nuôi giai đoạn 2020 – 2030, tầm nhìn năm 2040.
6. Lê Văn Thọ, Lê Xuân Cương (1979). Kích dục tố ứng dụng trong chăn nuôi. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
7. Nguyễn Đỗ Quyên (2004), Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất kháng thể đơn dòng, Luận án Tiến sĩ khoa học y dược.
8. Nguyễn Như Thanh (1997), Miễn dịch học Thú y. NXB Nông Nghiệp. Tr 7-10, 40-45. a. Nguyễn Tấn Anh (1998), Sinh lí sinh sản gia súc. NXB Nơng nghiệp, Hà Nội. 9. Nguyễn Xuân Tịnh, Tiết Hồng Ngân, Nguyễn Bá Mùi, Lê Mộng Loan (1996).
Sinh lý học gia súc. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
10. Phan Văn Kiểm, Nguyễn Bá Mùi (2005). "Định lượng progesteron trong máu, góp phần đánh giá tình trạng sinh sản của đàn bị sữa", Tạp chí khoa học kỹ thuật nơng nghiệp, Trường đại học nông nghiệp I Hà Nội, 3(2). Tr. 130-134.
11. Phan Văn Kiểm, Trịnh Quang Phong, Nguyễn Quý Quỳnh Hoa, Tăng Xuân Lưu (2003). “Ứng dụng kết quả nghiên cứu hàm lượng progesterone để chẩn đoán và điều trị rối loạn sinh sản ở bò sữa”, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, Hà Nội. Tr. 708-711.
12. Trần Tiến Dũng, Dương Đình Long, Nguyễn Văn Thanh (2002). Sinh sản gia súc. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
II. Tài Liệu Tiếng Anh:
13. Baruselli P.S., Reis E.L., Marques M.O., Nasser L.F., Bób G.A. (2004), The use of hormonal treatments to improve reproductive performance of anestrous beef cattle in tropical climates, Animal Reproduction Science. pp.479–486.
14. Baruselli P.S., Reis E.L., Marques M.O., Nasser L.F., Bób G.A. (2004). The use of hormonal treatments to improve reproductive performance of anestrous beef
cattle in tropical climates, Animal Reproduction Science. pp.479–486.
15. Fatıma Yücel & Beyazıt Çirakoğlu (1999). Production of Monoclonal Antibodies specific for Progesterone. Turk Journal of Biology.23: 393-399.
16. htpp://www.accessexcellence.org/RC/AB/MonoclonalAntibody.html
17. Köhler G. and Milstein C. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256 (5517). pp.495-497.
18. Liddell JE, Cryer A. (1991). A Practical Guide to Monoclonal Antibodies. John Wiley & Sons Ltd; Chichester:
19. Maurice J. Sauner, John A. Foulkes and Alan D Cookson (1981). “Direct enzyme immunoassay of progesteron in bovine milk”, Steroids, volume 38, number 1. UK. pp.45-52.
20. Nakao .T, Sugihashi . A, Saga .N, Tsunda .N and Kawata . K (1983). “An improved Enzyme immunoassay of progesterone applied to bovine milk”, Br. veterinary japan. pp.109-117.
21. Oliver JP.Leger and Jose.Wsaldanha (2000). Monocnonal Antibodies. Cell Feeder, pp.10-30.
22. Van De Weil .D.F.M and Koops. W (1986), “Development and validation of an Enzyme immunoassay for progesterone in bovine milk or blood plasma”, Annimal Reproduction Sience. pp.201-203.
23. Wu L.S, Guo I.C, Lin J.H (1997), “Pregnancy diagnosis on sows by using an on farm blood progesterone test”, Asia- Australasian journal of Animal Science. pp.603-608.
24. Yücel F. and B. Çirakoğlu (2000). Production of Monoclonal Antibodies specific for Progesterone, Estradiole by Simultaneous Injection of Different Steroids. Tr. J. Biology, 24: 697-05.