Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1. Kết quả về đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-08 qua các đờ
4.1.1. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào CPE của chủng virus
cường độc KTY-PRRS-08 qua các đời cấy chuyển
Theo mục đích của đề tài, chủng virus đại diện KTY-PRRS-08 được lựa chọn dùng để nghiên cứu chế tạo chủng virus PRRS nhược độc. Tiến hành cấy truyền liên tiếp 90 đời chủng này trên môi trường tế bào MARC-145. Do điều kiện thời gian thực tập hạn chế, số lượng các đời tương đối nhiều nên chúng tôi sẽ lựa chọn đại diện các đời cấy chuyển: Đời 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ( ký hiệu các đời P#1, P#20, P#30, P#40, P#50, P#60, P#70, P#80, P#90) Cụ thể chúng tôi chuẩn bị một khay 96 giếng tế bào MARC-145 đã mọc đều một lớp trên bề mặt nuôi cấy. Số lượng tế bào trong một giếng của khay được xác định bằng cách đếm 4 giếng đại diện ở 4 góc của khay 96 và tính trung bình. Sau đó, huyễn dịch chứa virus được đưa vào gây nhiễm cho các giếng tế bào theo lượng thích hợp. Khay tế bào gây nhiễm virus được ủ ở 37°C/5% CO2 để theo dõi CPE qua các thời điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ… sau khi gây nhiễm cho đến khi CPE không còn phát triển thêm trên các giếng tế bào nữa.
Ở mỗi đời tiếp truyền chúng tôi đều ghi chép thời gian xuất hiên bệnh tích và thời gian bệnh tích đạt 100%. Sau đó ở các đời 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 chúng tôi lại giám định lại virus bằng RT-PCR. Kết quả tiếp truyền đời virus cường độc KTY-PRRS-08 từ môi trường tế bào MARC-145 được trình bày ở bảng 4.1 và bảng 4.2.
Kết quả tiếp truyền cho thấy ở P#1, P#10, P#20 bệnh tích tế bào quan sát được xuất hiện sớm sau 12 giờ gây nhiễm, sau đó số lượng tế bào bị phá huỷ tăng dần sau 36 giờ gây nhiễm, đạt 45%, đạt 65% sau 48 giờ gây nhiễm và toàn bộ tế bào bị phá huỷ với bệnh tích đặc trưng sau 60 giờ gây nhiễm. Nhưng ở đời cấy chuyển P#30, P#40, P#50, P#60, P#70, P#80, P#90 thời gian xuất hiện bệnh tích tế bào được nhận thấy sớm hơn so với đời cấy chuyển P#20, sau 24 giờ gây nhiễm thì số lượng tế bào bị virus phá huỷ quan sát đạt 55%, sau đó đạt 85%- 90% sau 36 giờ gây nhiễm. Sau đó toàn bộ tế bào bong tróc khỏi đáy bình tế bào nuôi cấy ở thời điểm 60-72 giờ sau khi gây nhiễm.
Bảng 4.1. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) trên môi trường tế bào MARC-145
Đời tiếp
truyền Chủng Virus
Bệnh tích tế bào theo thời gian gây nhiễm virus (hpi) 12 24 36 48 60 72 P#1 KTY-PRRS-08 * 10 45 65 100 B P#10 * 10 45 65 100 B P#20 * 10 45 65 100 B P#30 20 50 85 100 B P#40 20 50 80 100 B P#50 20 55 85 100 B P#60 20 55 80 100 B P#70 20 55 85 100 B P#80 20 55 90 100 B P#90 20 55 85 100 B Chú thích :
-*: tế bào bị phá huỷ dưới 10%
-10*: 10% tế bào bị phá huỷ so với tổng diện tích dáy bình nuôi cấy (ước lượng bằng mắt khi soi trên kính hiển vi soi nổi).
-B: toàn bộ tế bào bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy.
Kiểm tra RT-PCR cho thấy có sự hiện diện của virus PRRS ở tất cả những đời tiếp truyền qua tế bào.
Bảng 4.2. Kết quả giám định bệnh tích tế bào bằng RT-PCR
Đời tiếp truyền Kết quả RT- PCR Đời tiếp truyền Kết quả RT- PCR Đời tiếp truyền Kết quả RT- PCR P#10 + P#40 + P#70 + P#20 + P#50 + P#80 + P#30 + P#60 + P#90 +
Như vậy, kết quả theo dõi khả năng gây bệnh tích tế bào ở chủng KTY- PRRS-08 cho thấy sau 30 đời cấy chuyển bệnh tích tế bào và sự phá huỷ tế bào xuất hiện sớm hơn và ổn định ở các đời cấy chuyển sau đó.
cũng như sức sống của virus được lựa chọn để nghiên cứu, cơ bản chủng virus sau khi gây nhiễm đều có khả năng nhân lên mạnh mẽ, gây ra bệnh tích tế bào và hủy hoại tế bào nhanh chóng và tương đối ổn định. Điều đó cho thấy phương thức bảo quản virus là khá tốt, đảm bảo được yêu cầu đặt ra. Vì vậy, các chủng virus này có thể tiếp tục dùng cho những nghiên cứu tiếp theo.